中国美利奴羊TLR4、TLR2基因多态性及其与布鲁氏菌病的相关性分析

1、中国美利奴羊TLR4、TLR2基因多态性及其与布鲁氏菌病的相关性分析目的 : 该实验分别探讨了绵羊TLR4、TLR2基因的多态性且分别对其基因的多态位点进行布鲁氏菌病的易感性的相关性分析, 然后进行单倍型的构建与分析,进一步得出和绵羊布鲁氏菌病有关的单倍型类型。分别将 TLR4、TLR2基因的 SNPs和绵羊的多种疾病进行关联研究, 这能为运用辅助标记选择法筛选优良绵羊新品种 , 即为进行 Toll样受体有关抗病机理方面的研究提供了理论基础。方法 :1 、该实验对采集的480 个绵羊血清进行了虎红平板凝集实验, 检测布鲁氏菌 , 利用生物信息学方法对NCBI上公布的绵羊的TLR4、 TLR2基

2、因外显子进行多态性比对分析 , 选出多态位点丰富的外显子片段进行引物的设计并扩增该基因片段 , 再利用 PCR-SSCP的技术方法分别对TLR4、TLR2基因的单核苷酸多态位点 (SNPs)进行检测 , 接着分别对具有不同等位基因型的绵羊个体进行克隆测序,利用分子生物学软件对测序结果进行相关性比对分析并利用SHEsis 在线软件对所有的 SNP位点分别进行其等位基因频率、基因型频率的差异性统计分析, 分析其与布鲁氏菌病易感性的相关性。2、分别将 80 个布鲁氏菌阳性个体与阴性的绵羊个体 TLR4的 PCR产物送测序 , 并对测序结果进行SNPs的检测 , 再用软件分别对其进行 Hardy-We

3、inberg 平衡的检测及连锁不平衡的分析, 最后利用 SHEsis 在线软件对得到的 SNPs进行单倍型的构建并对其单倍型进行相关性研究, 初步筛选与布鲁氏菌病易感性相关的单倍型。结果 :1 、用虎红平板凝集试验总共检测了480 只绵羊的血清 , 其中中国美利奴羊 290 只, 结果检测有 80 个布鲁氏菌感染阳性个体,210 个布鲁氏菌感染阴性个体。布鲁氏菌阳性检出率为27.59%。用虎红平板凝集试验检测哈萨克羊100 只 , 发现有 16 个布鲁氏菌阳性个体 ,84 个布鲁氏菌阴性个体。布鲁氏菌阳性检出率为 16%。用虎红平板凝集试验检测湖羊 90 只, 发现有 15 个布鲁氏菌阳性个体

4、 ,75 个布鲁氏菌阴性个体。布鲁氏菌阳性检出率为16.67%。2、TLR4 exon 3 的序列内共检测到7 个 SNP有 1 个位点为无义突变位点 , 其余 6 个为有义突变 , 其中不存在插入和缺失位点。 TLR2基因部分序列内有 8 个 SNP且都为无义突变位点。3、对 NCBI上下载的有关绵羊的所有的TLR4、TLR2的基因片段进行序列的相关性比对分析 , 结果表明不同绵羊品种之间的SNPs位点具有差异性。 4、该实验分别将 TLR4、TLR2基因的多态位点分别与布鲁氏菌病的易感性进行关联分析,可得出 TLR4基因上的 1180G/T 位点和中国美利奴羊布鲁氏菌病的易感性具有相关性

5、, 而其他多态位点的基因频率和基因型频率在布鲁氏菌病感染阳性组与阴性组中都没有有统计学意义。而 TLR2的 8 个位点都是无义突变因此可能和中国美利奴羊布鲁氏菌病易感性不相关。 5、对达到构建单倍型要求的 TLR4多态位点进行连锁不平衡遗传性分析 , 共得到 2 个 LD Block 在 TLR4第三外显子内 , 各个 SNPs之间也有一定连锁不平衡 , 将其按顺序称为 Block1-Block2 且都包含有两个 SNPs位点。Block1 包括 C1063 T、A1085 G。Block2 包括 C1088T、C1094G。6、对中国美利奴羊 TLR4基因进行单倍型构建时共构建了 7 种单倍

6、型类型 ,经分析发现 Hap2和 Hap4这两个单倍型的频率在感染阳性组中的频率分别为20.05%和 32.4%, 都明显比正常组高且其单倍型的频率分布具有差异有统计学意义 (P<0.05),因此可判断这两种单倍型可能和中国美利奴羊布鲁氏菌病的易感性有关。结论 :1 、对 GenBank中的有关绵羊所有的TLR4、 TLR2的基因片段进行序列比对分析 , 结果表明不同绵羊品种之间的SNPs位点具有差异性。2、通过分析发现在中国美利奴羊TLR4外显子 3 的序列内共检测到7 个 SNP,有 1 个位点为无义突变位点 , 其余 6 个均为有义突变。 TLR2基因部分序列内有8个 SNP且都为无义突变位点。推测中国美利奴羊TLR2基因的外显子区域可能相对比较保守。3、对绵羊TLR4、TLR2多态性与布鲁氏菌病易感性进行相关性分析, 发现 TLR4基因的1180G/T 位点可能与绵羊的布鲁氏菌病易感性有关联, 而其他 SNP位点的基因频率和基因型可能与布鲁氏菌病易感性不显著相关。4、对符合要求的 TLR4多态位点位点进行连锁不平衡分析总共得到2 个 LDBlock, 对所有的单倍型进行统计发现其中H