鲎抗脂多糖因子对晚期炎症因子高迁移率族蛋白1体外效应的拮抗作用

1、鲎抗脂多糖因子对晚期炎症因子高迁移率族蛋白1体外效应的拮抗作用 08-10-23 14:59:00 编辑：studa20 作者：吴林青, 许伟群, 张秋玉, 胡海霞, 祝先进, 苏东辉 【摘要】 目的 观察鲎抗脂多糖因子(LALF)对小鼠巨噬细胞晚期炎症因子高迁移率族蛋白1(HMGB1)功能的拮抗效应,探讨LALF对晚期内毒素血症动物的保护机制。 方法 用HMGB1刺激小鼠腹腔巨噬细胞,加入或不加LALF,迁移实验检测巨噬细胞趋化作用,ELISA检测培养上清液中肿瘤坏死因子(TNF)浓度。 结果 巨噬细胞迁移指数的增加呈HMGB1剂量依赖性,HMGB1刺激后巨噬细胞培养上清液TNF浓度显著增高

2、。LALF与HMGB1预混合显著降低巨噬细胞的迁移指数和培养上清液TNF浓度。 结论 LALF可能通过抑制HMGB1而发挥其对晚期脓毒症动物的保护作用。 【关键词】 高迁移率族蛋白; 脓毒症; 鲎抗脂多糖因子； 趋化作用ABSTRACT: Objective To investigate the effects of limulus antilipopolysaccharide factor(LALF) on the late proinflammatory cytokine of high mobility group box 1(HMGB1). Methods The primary mo

3、use macrophages were cultured and stimulated by HMGB1. Macrophage migration was determined by the use of chemotaxis chamber. ELISA quantitated the culture supernatants for TNF production. LALF was added to explore the effects of HMGBI and TNF production in culture. Results The chemotactic index of m

4、acrophages and the concentration of TNF in the culture supernatants evidently increased in dosedependent manner in HMGB1 groups and prominently decreased by the LALF coincubated. Conclusion HMGB1 was firstly indicated in this study to be directly inhibited by LALF in late course of endotoxemia. KEY

5、WORDS: high mobility group proteins; sepsis; macrophage; horseshoe crabs; lipopolysaccharides; tumor necrosis factoralpha; inflammation脓毒症是重症监护病房病人常见的死因。肿瘤坏死因子(TNF)、白细胞介素(IL)1等促炎症因子曾被普遍认为是引起脓毒症死亡的“核心因子”1,以往认为在这些促炎症因子达峰以后再给予抗内毒素的治疗难以逆转脓毒症的病程。具有重要意义的是,Levin实验室给致死量细菌内毒素即脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)攻击后4，

6、10 h甚至24 h的Swiss小鼠注射天然鲎抗脂多糖因子(limulus antilipopolysaccharide factor,LALF)，实现了对动物晚期脓毒症的有效保护2,提示LALF可能对促炎症因子消退后的某个或某些晚期介质起拮抗作用。1999年,Wang等发现高迁移率族蛋白1(highmobility group box 1,HMGB1或HMG1)是脓毒症致死性全身反应的一种重要的晚期促炎性因子3。本研究以体外培养的小鼠巨噬细胞为实验对象,观察LALF对HMGB1部分生物学活性的影响,探讨LALF对脓毒症晚期的实验动物发挥保护作用的机制。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 动

7、物 昆明种小鼠,雄性,体质量2025 g福建医科大学实验动物中心,许可证号scxk(闽)20050003。饲以标准饲料,随意饮水。1.1.2 主要试剂 RPMI1640培养基、PBS平衡盐溶液(美国Hyclone公司)。E.coli O55:B5 LPS、重组HMG1(美国Sigma公司)。48孔微迁移板(AP48,美国Neuro Probe公司)。TNF ELISA试剂盒(深圳晶美生物工程有限公司)。LALF（美国麻萨诸塞州Woodhole海洋生物实验室Wainright博士惠赠）。大鼠抗小鼠TLR2(IgG)FITC及正常大鼠IgGFITC(美国Santa Cruz公司)。1.2 方法1.

8、2.1 小鼠腹腔巨噬细胞制备 颈椎脱臼处死小鼠,以PBS腹腔灌洗法收集腹腔巨噬细胞悬液,1 500 r/min(4 )离心10 min,弃上清,洗涤1次,用含10胎牛血清的1640培养液调整细胞浓度为1106 mL-1,根据需要接种于24孔(1 mL/孔)或6孔(2 mL/孔)细胞培养板中,置37 CO2培养箱培养4 h后去除未贴壁细胞换液继续培养备用。1.2.2 趋化实验 参照文献45方法。将含不同浓度HMGB1的无血清培养液25 L加入下室,同时以细胞稀释液作为阴性对照。另一组在趋化板下室的细胞中加入不同浓度LALF与HMGB1预混合培养液,同时设单独培养液、单独LALF和单独HMGB1对

9、照组。再将1片5 m孔径的聚碳酸酯膜覆盖在小室上,最后将巨噬细胞(1106 mL-1)50 L加入到上室中,置于37 、体积分数为0.05的CO2培养箱中孵育90 min。孵育后聚碳酸酯膜用甲醇固定并进行考马斯亮蓝染色。在光学显微镜下用高倍镜计数5个视野下的迁移细胞数,结果用迁移指数表示: 迁移指数试验组迁移的细胞数/对照组迁移的细胞数一式3份,重复3次实验。1.2.3 ELISA 检测培养上清液的TNF浓度 小鼠腹腔巨噬细胞接种于24孔细胞培养板,在不同时间加入含1 g/mL HMGB1的培养液,设单独培养液的对照组。另一组细胞加入不同浓度LALF与HMGB1 1 g/mL预混合培养液,继续

10、培养8 h,设单独培养液、单独LALF、单独HMGB1的对照组。吸取培养上清,用双抗体夹心ELISA法检测TNF含量,操作方法按说明书进行。一式3份,重复3次。1.3 统计学处理 测定结果数据以xs表示,采用SPSS 10.0统计软件进行分析,组间差异以单因素方差分析进行检验,P0.05为差别具有统计学意义。2 结果2.1 LALF对HMGB1诱导巨噬细胞趋化作用的影响2.1.1 HMGB1对巨噬细胞趋化作用的诱导 HMGB1显著提高小鼠腹腔巨噬细胞的迁移指数,其峰值所对应的HMGB1浓度为1 g/mL。在0.11 g/mL浓度区间,HMGB1的效应呈剂量依赖性(图1)。HMGB1:晚期炎症因

11、子高迁移率族蛋白1. 与HMGB1 0 g/mL对照组比较,:P0.01.图1 不同浓度HMGB1对巨噬细胞迁移的作用（略）Fig 1 Effect of HMGB1 on macrophage migration2.1.2 LALF对HMGB1诱导趋化作用的影响 不同浓度LALF(5,10,15 g/mL)与1 g/mL HMGB1预混合巨噬细胞迁移试验显示,LALF显著降低巨噬细胞的迁移指数,这种抑制效应呈LALF剂量依赖性。单独LALF对巨噬细胞的迁移指数无影响(图2)。2.2 LALF对HMGB1诱导巨噬细胞分泌TNF的影响2.2.1 HMGB1对巨噬细胞分泌TNF的诱导 对照组单独使用培养液刺激小鼠腹腔巨噬细胞产生TNF(355)pg/mL。加入1 g/mL HMGB1 4, 8,24 h测定值分别为(72535),(83930),(58640)p