液相色谱_串联质谱法快速同时测定婴幼儿配方乳粉中氯霉素_三聚氰胺_甲硝唑和洛硝达

1、液相色谱-串联质谱法快速同时测定婴幼儿配方乳粉中氯霉素、三聚氰胺、甲硝唑和洛硝达唑王 浩*杨红梅郭启雷刘艳琴史海良田艳玲( 国家食品质量安全监督检验中心，北京 100094)摘 要 建立了婴幼儿配方乳粉中三聚氰胺、氯霉素、甲硝唑和洛硝达唑残留的高效液相色谱-串联四极杆质谱联用测定方法。样品经碱性乙腈提取，以 MG -C18 色 谱 柱 ( 150 mm2 1 mm，5 !m) 分 离，流 动 相 为×60 mmol / L 乙酸铵溶液( 含 0 4甲酸) 和甲醇，梯度洗脱，流速为 0 25 mL / min。采用多反应监测正离子或负离子模式，可以同时对婴幼儿配方乳粉中的三聚氰胺、氯霉

2、素、甲硝唑和洛硝达唑进行快速定性和定量测定。 在优化条件下，4 种化合物检出限为 0 3 50 0 !g / kg，方法回收率为 61 4% 96 2% ，相对标准偏差( RSD) 为1 8% 9 8% 。采用本方法测定了多种市售婴幼儿配方奶粉。本方法操作简单、测定结果准确，可用于婴 幼儿配方奶粉中三聚氰胺、氯霉素、甲硝唑和洛硝达唑残留的同时快速测定。关键词 液相色谱-串联质谱; 氯霉素; 三聚氰胺; 甲硝唑; 洛硝达唑; 乳粉1引言婴幼儿配方乳粉营养丰富，是婴幼儿成长发育的一种主要食物。随着食品安全关注度的提高，婴幼儿配方乳粉中的药物残留日益成为关注的焦点。三聚氰胺是一种化工材料，有肾毒性，

3、作为添加剂并没有实际作用。但不法商贩为“提高”蛋白质 含量，降低生产成本，在乳粉添加了三聚氰胺。氯霉素是一种广谱抗生素，能抑制细菌蛋白质的形成，但 对人类也具有毒害作用，如它对骨髓造血机能有抑制作用，可引起粒细胞缺乏病、再生障碍性贫血和溶 血性贫血等毒副作用。由于氯霉素价格低廉，抗病性强，给奶牛非法服用氯霉素的情况时有发生，以致 乳粉中会存在氯霉素残留; 甲硝唑和洛硝达唑具广谱抗厌氧菌和抗原虫的作用，主要用于预防和治疗厌 氧菌引起的感染，我国已经命令禁止在饲料中添加。目前，测定氯霉素、三聚氰胺、甲硝唑和洛硝达唑的方法主要有液相色谱 法1 6、气 相 色 谱-质 谱 法7，8、酶联免疫法9及液相

4、色谱-串联质谱法等10 14。液相色谱-质谱联用技术是近年来新兴的检测 技术，由于其准确、高效和高灵敏度，符合目前食品安全检测所追求的快速高效的要求，目前还未见液 相色谱-串联质谱联用法用于同时检测氯霉素、三聚氰胺、甲硝唑和洛硝达唑的报道。本研究采用碱性 乙腈提取目标物，采用高效液相色谱串联质谱仪进行检测，前处理简单，灵敏度高，适合于婴幼儿配方 乳粉中氯霉素、三聚氰胺、甲硝唑和洛硝达唑的同时快速检测。2实验部分2 1 仪器与试剂6410 型串联三重四极杆质谱( 美国 Agilent 公司) ; 配 Agilent1200 型液相色谱仪; KQ-5200 型超声 波清洗仪( 昆山市超声仪器有限公

5、司) ; TGL-16M 型高速台式冷冻离心机( 湘仪离心机仪器有限公司) 。 Milli-Q 去离子水发生器( 美国 Milli-Q 公司) ;乙腈、甲醇( 色谱纯，Fisher 公司) ; 甲酸、乙酸铵、三乙胺、冰醋酸( 分析纯，北京化工厂) ; 氯霉素、三 聚氰胺、甲硝唑和洛硝达唑( 纯度99% ，Sigma 公司) 。2012-06-05 收稿; 2012-09-03 接受本文系国家质检总局质检公益性行业科研专项( No 200910267-02) 资助* E-mail: haowang2003 163 com分 析 化 学第 41 卷2842 2 样品前处理称取 4 0 g 样品，精

6、确至 0 01 g，置于 100 mL 比色管中，加水 35 mL，充分溶解后超声提取 5 min，再 用含 1% 氨水的乙腈溶液定容。超声波提取 20 min，上清液经滤纸过滤，吸取 25 mL 滤液至 100 mL 蒸 发瓶内，于 45 水浴中减压蒸馏至 3 mL 左右，加水充分溶解后定容至 5 mL，滤纸过滤后待测( 如浑浊 严重，以 8000 r / min 高速离心 10 min，取上清液过滤)2 3标准溶液的配制标准储备液: 分别称取适量的氯霉素、三聚氰胺、甲硝唑和洛硝达唑标准品，再分别用甲醇配制成0 1 g / L 的标准储备液，于#18 保存。标准工作溶液: 分别吸取适量标准储

7、备液于 100 mL 容量瓶中，用水定 容，配制成标准工作溶液。4 种禁用物质浓度为: 氯霉素、洛硝达唑、甲硝唑: 100 !g / L; 三聚氰胺:空白样品提取液: 选择阴性样品，按 2 2 节操作。基质混合标准工作溶液: 根据仪器的灵敏度和线性范围，吸取适量标准工作溶液，用空白样品提取 液配成系列浓度的基质混合标准工作溶液。10 mg / L。色谱-质谱条件液相色谱 条 件: 资 生 堂 MG -C18 色 谱 柱 ( 1502 4mm × 2 1 mm，5!m) ; 流 速: 0 20 mL / min; 柱 温:25 ; 进样量: 20 !L; 流动相为甲醇( A 相) 和

8、60 mmoL / L 乙酸铵缓冲溶液( 含 0 04% 甲酸) ( B 相) ; 梯度洗脱程序: 0 5 min，95% A ; 5 20 min，95% 65% A; 20 25 min，65% 5% A; 25 35 min，5% A。质谱条件: 电喷雾离子源( ESI) ; 扫描方式: 三聚氰胺、洛硝达唑、甲硝唑为正离子模式，氯霉素为负 离子模式; 检测方式: 多反应检测; 干燥气: N2 ; 雾化气压力: 275 8 kPa; 干燥气温度: 340 ; 干燥气流 速: 8 L / min; 定性离子对、定量离子对及碰撞能量见表 1。表 1 氯霉素、三聚氰胺、甲硝唑和洛硝达唑的质谱参数

9、Table 1 Parameters of mass spectra of melamine，chloramphenicol，metronidazole，ronidazole母离子Parent ion( m / z)子离子Product ion( m / z)碎裂电压Fragment voltage( V)碰撞能量Collision energy( V)被测物质名称Name of compound85 1 * ，68 0152 0 * ，257 082 0 * ，128 2140 * ，55 1三聚氰胺 Melamine氯霉素 Chloramphenicol 甲硝唑 Metronidazole

10、 洛硝达唑 Ronidazole127 0321 0172 1201 0100801006015，2015，525，105，20* 定量离子( Quantitative ion) 。3 结果与讨论样品前处理方法的优化乳粉需要用水溶解后再进行提取，如果加水比例小于 1 7 5，三聚氰胺回收率加标回收率 50% ; 但加水比例过高，又会影响其它目标化合物的检出限。综合考虑，确定乳粉与水的比例为 1 7 5。为了 充分提取样品中氯霉素、三聚氰胺、甲硝唑和洛硝达唑残留，本实验分别选择乙腈、甲醇、乙酸乙酯及含1% 氨水的乙腈为样品提取液，但前 3 种提取液的提取效果均不理想; 只有含 1% 氨水的乙腈能

11、有效地 提取样品中目标化合物，因此，选择此溶液作为样品提取液。3 2 质谱条件的优化采用直接进样方式分别将浓度为 0 1 mg / L 的三聚氰胺、洛硝达唑、甲硝唑和氯霉素的标准溶液注 入离子源中，在正离子或负离子检测方式下进行母离子全扫描，分别得到目标化合物的分子离子峰。以 每种目标化合物的准分子离子峰为母离子，进行二级质谱扫描，最后采集全扫描的二级质谱图，得到碎 片离子信息，然后再对得到每种目标化合物的二级质谱参数( 如破碎电压、碰撞能量等) 进行优化，使每 种目标化合物的定性离子与定量离子产生的离子对强度比例达到最大时为最佳( 结果见表 1) 。3 1第 2 期 王 浩等: 液相色谱-串

12、联质谱法快速同时测定婴幼儿配方乳粉中氯霉素、三聚氰胺、甲硝唑和洛硝达唑2853 3 色谱条件的优化3 3 1 色谱柱的选择 为了有利于色谱峰的分离及峰形的改善，本方法分别采用资生堂 MG-C18 色 谱柱( 150 mm × 2 1 mm，5 !m) ，ZORBAX Eclipse XDB-C18 色谱柱和 ZORBAX SB-Aq 色谱柱( 150 mm ×2 1 mm，3 5 !m) 进行分离实验。实验表明，资生堂 MG-C18 色谱柱( 150 mm × 2 1 mm，1 8 !m) 的 分离效果较好。色谱分离条件选择 三聚氰胺、洛硝达唑、甲硝唑和氯霉素的化

13、合物结构差异较大( 如果流动3 3 2相不含酸性物质，洛硝达唑和甲硝唑色谱峰严重展宽) ，且需要正负两种电离模式，为了有利于色谱峰的分离及同时检测的要求，本方法采用 60 mmoL / L 乙酸铵溶液( 0 4甲酸) -甲醇为流动相，利用梯度 洗脱的方法提高分离及检测效果。测试开始时，流动相中 60 mmoL / L 乙酸铵溶液( 0 4甲酸) -甲醇的 体积比为 95 5，并在 0 5 min 保持此比例，这部分主要是洗脱测定液中极性较强的三聚氰胺; 5 20 min 内，将二者的比例改变为 65 35，这部分主要是洗脱测定液中的杂质; 20 25 min 内将二者的比例 改变为5 95，这

14、部分主要是洗脱测定液中洛硝达唑、甲硝唑和氯霉素。通过上述两步梯度，在 33 min 内，可以较好地分离测定液中三聚氰胺、洛硝达唑、甲硝唑和氯霉素，结果见图 1。图 1 三聚氰胺、甲硝唑、洛硝达唑和氯霉素 4 种化合物的加标 MRM 色谱图Fig 1 MRM chromatogram of a blank sample spiled with 4 compounds1 三聚氰胺 ( Melamine) ; 2 洛硝达唑( Ronidazole) ; 3 甲硝唑( Metronidazole) ; 4 氯霉素( Chloramphenicol) 。进样量的选择 增大进样量，可提高测定的灵敏度，但是

15、容易污染色谱柱。实验发现，当进样量3 3 3达到 20 !L 时，灵敏度能达到要求，且对色谱柱影响不大。3 4 线性范围与检出限用空白样品提取溶逐级稀释的标准工作液，分别进样 20 !L，测定结果经线性回归 ( y 为峰面积，Counts;x 为浓度，!g / L) ，同时用空白样品进行加标实验，在信噪比均大于 3 的条件下能检出，将此添加量定为检出限，结果见表 2。表 2 氯霉素、三聚氰胺、甲硝唑和洛硝达唑 4 种化合物的线性方程、线性关系、相关系数及检出限Table 2 Linear equation， correlationronidazolemelamine， chlorampheni

16、col， metronidazole，coefficient andlimitsof detectionfor相关系数Correlationcoefficient( r)检出限线性范围Linear range( !g / kg)被测物质Name of compound线性方程Linear equationLimits of detection( S / N = 3，!g / kg)三聚氰胺 Melamine洛硝达唑 Ronidazole 甲硝唑 Metronidazole 氯霉素 Chloramphenicoly = 4351 9x + 31576 7y = 116900 7x 11883 9

17、y = 74458 1x 2692 1y = 24748 6x + 375 98150 1250015 12515 1250 5 500 99930 99950 99990 9992505 05 00 33 5方法的回收率和精密度每组准确称取空白样品 6 份，每份 4 0 g，共 3 组，分别定量加入目标标准物质。按供试品溶液制备方法制备后进行测定，结果见表 3。从表 3 可见，不同浓度平均加标回收率 60 1% 96 2% ，平均相对标准偏差为 1 8% 9 8% ( n = 6) 。图 1 为加标样品中 MRM 色谱图。分 析 化 学第 41 卷286表 3 氯霉素、三聚氰胺、甲硝唑和洛硝

18、达唑等 4 种化合物的加标回收率( n = 6)Table 3 Recoveries and relative standard deviationds ( RSD) of 4 compounds in spiked samples ( n = 6)加入量回收率Recovery( % )加入量回收率Recovery( % )加入量回收率Recovery( % )分析物AnalytesRSD( % )RSD( % )RSD( % )Added(Added( !g / kg)Added( !g / kg)!g / kg)三聚氰胺 Melamine洛硝达唑 Ronidazole 甲硝唑 Metron

19、idazole 氯霉素 Chloramphenicol505 05 00 560 175 076 678 09 78 86 88 850025255 064 276 180 982 29 88 81 82 725002502502568 174 682 796 28 97 63 91 93 6 实际样品检测利用本方法对市场销售的 20 种婴幼儿配方乳粉进行检测，其中一种含有氯霉素( 浓度为 0 31 !g / kg) ，其余未检出。实验表明，本方法的样品前处理简单易行，分析快速，能为婴幼儿配方乳粉中禁用物 质的监管与监督提供技术依据。References1LUO Wen-Ting，WU Qin

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27、氰胺、甲硝唑和洛硝达唑287Simultaneous Determination of Chloramphenicol，Melamine，Metronidazole，Ronidazole in Infant Milk Powder by LC-MS / MSWANG Hao* ，YANG Hong-Mei，GUO Qi-Lei，LIU Yan-Qin，SHI Hai-Liang，TIAN Yan-Ling( China National Food Safety Supervision and Inspection Center，Beijing 100094，China)A quick conf

28、irmative method was developed for determining the residues of chloramphenicol，Abstractmelamine，metronidazole and ronidazole in infant milk powder by LC-MS / MS The sample was extracted withmethanol ( Including 0 5% formic acid ) ，the HPLC separation was carried out on aMG -C18column( 150 mm × 2 1 mm，5 !m) ，the mobile phase was 60 mmol / L ammonium acetate solution ( Including 0 4formic acid )and methanol with gradient elution， the flow rate was 0 25 mL / min The detection of chloramphenicol，melamine，metronidazole and ronidazole was carried out in the positive and negative multi-