葶苈生脉饮对压力负荷大鼠心肌组织MMP9及TIMP1表达的影响

1、葶苈生脉饮对压力负荷大鼠心肌组织MMP9及TIMP1表达的影响                           作者：赵淑明 郭秋红 张志良 吴迪 周桦 张一昕 【摘要】  目的 观察葶苈生脉饮对压力负荷增加致充血性心力衰竭(CHF)大鼠心肌组织基质金属蛋白酶9(MMP9)及基质金属蛋白酶组织抑制因子1(TIMP1)表达的影

2、响。方法 建立腹主动脉缩窄所致充血性心力衰竭大鼠模型，随机分为假手术组、模型组、葶苈生脉饮高剂量组、葶苈生脉饮低剂量组、阳性药(心宝丸)对照组。使用MS4000 U生物信号定量记录分析系统检测各组大鼠的LVSP、LVEDP、±dp/dtmax变化;采用免疫组化法观察各组大鼠心肌组织MMP9、TIMP1的表达情况。结果 模型组大鼠LVEDP、dp/dtmax升高，MMP9表达增强(P<0.05或P<0.01);LVSP、+dp/dtmax降低，TIMP1表达减弱(P<0.05或P<0.01)。各给药组与模型组比较， LVEDP、dp/dtmax降低，MMP9表达

3、减弱(P<0.05或P<0.01);LVSP、+dp/dtmax升高，TIMP1表达增强(P<0.05或P<0.01);其中高剂量组明显优于低剂量组和心宝组(P<0.05或P<0.01)。结论 葶苈生脉通过调控MMP9和TIMP1的表达，可能是其逆转心室重塑、增强心脏功能、治疗CHF的作用机制之一。 【关键词】  葶苈生脉饮;心力衰竭; MMP9; TIMP1【Abstract】 Objective To observe the effects of Tinglishengmaiyin on the expressions of matrix me

4、talloproteinases9 (MMP9) and tissue inhibitor of metalloproteinases (TIMP1) in the myocardiac tissue of rats with congestive heart failure (CHF) induced by over loaded pressure. Methods The model rats with CHF were established by suprarenal aortic constriction operation and divided into 5 groups ran

5、domly: sham operated, model control, Tinglishengmaiyin high, low dose groups and Xinbaowan group. The MS4000U biological signal collecting system was used to record and analyze the changes of LVSP, LVEDP and±dp/dtmax. Immunohistochemical method was used to observe the expressions of MMP9 and TI

6、MP1. Results In model control group, the LVEDP, dp/dtmax, the expression of MMP9 increased (P<0.05 or P<0.01) and the LVSP, +dp/dtmax, the expression of TIMP1 decreased (P<0.05 or P<0.01). Compared with model control group， LVEDP, dp/dtmax, the expression of MMP9 decreased (P<0.05 or

7、P<0.01), LVSP,+dp/dtmax, the expression of TIMP1 increased (P<0.05 or P<0.01) in the treatment groups. High dose group was significantly superior to low dose group and Xinbaowan group (P<0.05). Conclusions Tinglishengmaiyin can adjust the expressions of MMP9 and TIMP1, which may be one o

8、f the mechanisms of reversing myocardial model and improving heart function to treat CHF.【Key words】 Tinglishengmaiyin; Heart failure; MMP9; TIMP1 心室重塑是充血性心力衰竭发生发展的重要病理生理过程，是由于一系列复杂的分子和细胞机制导致的心肌结构、功能变化。近年研究发现，基质金属蛋白酶(MMPs)及内源性基质金属蛋白酶组织抑制因子(TIMPs)的表达变化在心室重塑及心力衰竭的发展过程中具有显著作用1 。但有关中药对CHF时MMPs及TIMPs表达变化

9、影响的报道较少。葶苈生脉饮是根据中医理论及多年临床实践研制出的治疗CHF的效方。为了进一步阐明其作用机制，本文观察了其对压力超负荷致充血性心力衰竭大鼠模型心肌组织MMP9及TIMP1表达的影响。     1 材料与方法1.1 药物 葶苈生脉饮(河北医科大学中医学院制剂室制备)由葶苈子、红参、黄芪、五味子、丹参等组成，实验时用蒸馏水分别配成1.5、3.0 g/ml浓度的混悬液;心宝丸(汕头市麒麟药业有限公司生产，批号：20070631)，实验时研磨成极细末，用蒸馏水配成浓度为0.024 g/ml的水溶液，放置4贮存备用。1.2 仪器与试剂 MS4000U生

10、物信号定量记录分析系统(广州市龙飞达科技有限公司);DGB20电热干燥箱(上海光华仪器厂)，2010水浴箱(天津泰斯特仪器有限公司)，CU600恒温水浴震荡器(姜堰市医疗器械有限公司)，BD120冰箱(青岛海尔股份有限公司)，NikonFXA尼康光镜显微照相机(日本尼康株式会社)，LEICA RM2125石蜡切片机(莱卡上海分公司)，Motic6.0数码医学图像分析系统(厦门麦克奥迪仪器仪表有限公司)。MMP9、TIMP1免疫组化试剂盒(武汉博士德生物公司)。1.3 动物模型的建立、分组与给药 健康成年Wistar大鼠60只，雌雄各半，体质量160200 g(河北省实验动物中心提供)。随机分为

11、5组：假手术组、模型组、葶苈生脉饮高剂量组、葶苈生脉饮低剂量组、心宝丸对照组，每组12只。动物造模参照相关文献2 ，用1%戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔注射麻醉，剑突下腹正中切口，分层打开腹腔;在肾动脉水平以上钝性游离腹主动脉，将7号针头平行置于腹主动脉上，用0号手术丝线将腹主动脉和针头一同结扎，然后缓慢将针头撤出，使大鼠腹主动脉直径缩窄为0.7 mm，最后分层缝合关腹。假手术组开腹后将手术丝线穿过腹主动脉，不结扎，其他操作与手术组完全相同。于造模4 w后开始给药。葶苈生脉饮高剂量组、低剂量组分别按30、15 g/kg体重的标准灌服，对照组按0.24 g/kg体重的标准灌服，正常组和模型组

12、灌服生理盐水。各组1次/d灌胃，每次用药体积均按1 ml/100 g计算，持续4 w。实验过程中假手术组、模型组、高剂量组、低剂量组、心宝组各死亡0、3、2、3、2只，最后进入检测的动物分别为12、9、10、9、10 只。1.4 检测指标1.4.1 血液动力学测定 于末次灌胃后禁食12 h，用20 %乌拉坦(0.75 g/kg)腹腔注射麻醉后，将大鼠固定于实验台，分离右颈总动脉，在动脉壁剪一小口，插入直经为1 mm带肝素的心导管，经压力转换器接ms4000 u型生物信号定量分析系统，缓慢推进导管，观察示波器，当出现左室波型后停止推进，稳定2 min后记录LVSP、LVEDP、±dp/

13、dtmax等。1.4.2 免疫组化法检测MMP9、TIMP1表达 于末次灌胃后禁食12 h，麻醉状态下迅速剖取心脏，切取约0.5 cm3大小的左室组织，用4%多聚甲醛溶液固定，石蜡包埋，切片脱蜡水化后分别做MMP9及 TIMP1的免疫组织化学染色。采用常规亲和素生物素过氧化物酶技术，以磷酸缓冲液代替一抗作为阴性对照，MMP9、TIMP1阳性表现为胞浆染成浅黄色、棕黄色。每个标本选取3张切片，每张切片取5个视野，采用Motic6.0数码医学图像分析系统，检测MMP9和TIMP1蛋白表达情况(积分吸光度)，取平均值。1.5 统计学处理 所有数据均采用SPSS 12.0统计软件包进行分析，数据结果以

14、x±s表示，组间比较用单因素方差分析。2 结 果2.1 葶苈生脉饮对实验大鼠血流动力学的影响 见表1。与假手术组比较，模型组LVSP、+dp/dtmax显著降低(P<0.01)，LVEDP、dp/dtmax显著升高(P<0.01);与模型组比较，各治疗组LVSP、+dp/dtmax显著升高(P<0.01)，LVEDP、dp/dtmax显著降低(P<0.01)。其中，高剂量组+dp/dtmax高于心宝组和低剂量组(P<0.01)，dp/dtmax低于心宝组和低剂量组(P<0.01);低剂量组+dp/dtmax低于心宝组，dp/dtmax高于心宝组(P

15、<0.01);而LVSP、LVEDP的变化在各治疗组之间无明显差异(P>0.05)。表1 各组大鼠血流动力学结果比较(x±s)与模型组比较：1)P<0.05，2)P<0.01;与心宝组比较：3)P<0.01;与低剂量比较：4)P<0.01     2.2 葶苈生脉饮对实验大鼠心肌组织MMP9、TIMP1表达的影响 见表2。与假手术组比较，模型组MMP9的表达及MMP9/TIMP1比值明显升高(P<0.01)，TIMP1的表达明显降低(P<0.01);与模型组比较，各治疗组MMP9表达及MMP9/T

16、IMP1比值明显降低(P<0.01)，TIMP1表达明显升高(P<0.01)。其中，高剂量组MMP9的表达及MMP9/TIMP1比值低于低剂量组和心宝组(P<0.01)，TIMP1的表达高于低剂量组和心宝组;低剂量组与心宝组比较各项指标变化无明显差异(P>0.05)。表2 各组大鼠心肌组织MMP9、TIMP1蛋白表达及MMP9/TIMP1的比较3 讨 论MMPs是一组能特异地降解细胞外基质(extracellularmatrix，ECM)成分的锌(Zn2+)依赖酶家族，可降解除多糖以外的所有细胞外基质成分;还可通过基质降解时释放强有力的基质合成分子如基质素及一些生物活性

17、因子，包括转化生长因子(TGF1)、成纤维细胞生长因子(FGF)等调节胶原的合成，最终破坏心脏纤维胶原网络导致心肌纤维化心室重构心脏泵功能衰竭。MMPs在心室重构和心力衰竭中起着重要作用3 。MMPs主要分为胶原酶、明胶酶、基质溶解素及膜型MMPs (MTMMP)。明胶酶包括明胶酶A(MMP2)和B(MMP9)，两种明胶酶是目前研究较多且具有降解间质蛋白的作用4 ，其中，MMP9在心衰的发生发展中起着更为重要的作用 5 。 内源性基质金属蛋白酶组织抑制因子(TIMPs)是MMPs的特异性抑制剂。包括有TIMP1、TIMP2、TIMP3、TIMP4。正常情况下，TIMPs与MMPs呈11的比例形

18、成MMP-TIMP复合物阻断MMPs与底物结合，调节MMPs的活性。其中TIMP1可有效抑制除MMP2和MT1MMP以外大多数MMPs的表达。据报道，敲除TIMP1的小鼠，左室几何形状发生改变。心肌组织中TIMP含量降低，且MMPs增加，心腔变形、扩大，造成心室重构6 。正常情况下，具有降解细胞外基质的MMPs和抑制MMPs的内源性TIMPs的良好平衡在维持正常的心脏结构和功能中起重要作用。心衰发生后，降解细胞外基质的MMPs升高，而MMPs内源性抑制剂TIMPs下降，两者比例失调。慢性心衰属于祖国医学的心悸、怔忡、咳喘、水肿等病证的范畴。气虚、血瘀、水停是心衰的基本病机，属于本虚标实之证，即心脏气虚为本，血瘀水停为标。益气活血，强心利水为其有效治法。因此，精心筛选相关药物组成葶苈生脉饮，经临床应用疗效满意。方中黄芪益气利水;葶苈子强心利水;丹参、红花活血祛瘀;益母草活血利水;