细胞毒T淋巴细胞相关抗原4基因多态性与乳腺癌易感性的关联研究

1、细胞毒T淋巴细胞相关抗原4基因多态性与乳腺癌易感性的关联研究         11-01-31 13:02:00     编辑：studa20          作者：李恒, 傅振坤, 王丽虹, 李大林, 吴娜, 章婕, 李殿俊【摘要】  目的: 探讨CTLA4基因多态性位点1722T/C和CT60G/A与中国北方汉族妇女乳腺癌易感性的关系。方法: 采用聚合酶链反应（PCR）和

2、限制性片段长度多态性方法, 对328例中国北方汉族乳腺癌患者和327例正常对照者进行CTLA4基因1722位点和CT60位点多态性检测。 结果: 乳腺癌患者CTLA4基因CT60位点G等位基因频率在乳腺癌患者组中明显高于正常对照组（28.7% 比23.5%; P=0.0352, OR=1.30, 95% CI=1.021.67）; 1722CCT60A单体型在对照组中的频率大于病例组中的频率, 有明显差异（P=0.0283, OR=0.77, 95% CI=0.970.61）, 而在1722位点基因型频率、 等位基因频率与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论: CTLA4基因

3、多态性1722和CT60两个位点与我国北方汉族妇女乳腺癌发病存在一定的相关性。 【关键词】  乳腺癌 CTLA 4基因 单核苷酸多态性 单体型Abstract  AIM: To investigate the association between the CTLA4 promoter1722(T/C) and 3 untranslated region CT60(G/A) polymorphisms and the risk of breast cancer in Han women of northeast China. METHODS: 328 patients wi

4、th breast cancer and 327 healthy people as control were genotyped for 1722 and CT60 polymorphism using polymerase chain reaction and restriction fragment length polymorphism. RESULTS: The frequency of the G allele at the CT60 site in breast cancer patients was statistically higher than that in contr

5、ol（28.7% vs 23.5%, P=0.0352, OR=1.30, 95% CI=1.02-1.67）. The frequency of 1722CCT60A haplotype in control was significantly higher than that in breast cancer patients（P=0.0283, OR=0.77, 95% CI=0.97-0.61）. However, the distribution of genotypes at 1722 site was not significantly different between bre

6、ast cancer patients and control. CONCLUSION: The polymorphism of 1722T/C and CT60G/A may be related to the development of breast cancer in Han women of northern China.Keywordsbreast cancer; CTLA4 gene; single nucleotide polymorphism; haplotype乳腺癌是危害妇女健康的常见恶性肿瘤, 其发病机制虽然尚未完全清楚, 但是免疫系统在其中的作用已逐渐引起了人们的关注

7、。有研究表明, 乳腺癌患者体内存在免疫系统的抑制性环境, 特别是在年轻患者和病情严重患者更为明显, 其中T细胞表面的细胞毒T淋巴细胞相关抗原4（CTLA4）分子发挥了重要作用1。人类CTLA4基因定位于2号染色体长臂33带（2q33）, 主要表达在活化的T细胞上, 它可与抗原提呈细胞表面的B7分子结合并抑制T细胞的增殖与活化2。有研究表明位于CTLA4基因3端非编码区和基因启动子区的基因变异影响了CTLA4的表达和转录, 其中单核苷酸多态性位点CT60显示出了较强的关联性, 但并不能排除其他位点的作用3。为了进一步验证上述基因遗传多态性是否与我国北方汉族妇女乳腺癌的发生相关, 我们选择了转录本

8、末端CT60G/A位点和基因启动子区的1722T/C位点进行了此次病例的对照研究。1  材料和方法1.1  对象及材料  乳腺癌病例为在哈尔滨医科大学附属肿瘤医院进行手术治疗的患者, 共340例, 均经组织病理学确诊, 术前均未行放射或化学治疗, 年龄3073岁, 经患者本人及家属同意的情况下, 取空腹外周静脉血。正常对照组人群外周血由哈尔滨医科大学附属第一医院提供的体检女性获得, 共350例, 平均年龄为(46.3±17.0)岁, 要求没有癌症家族史, 其他详细记录与乳腺癌患者相同。DNA提取试剂盒购自天为时代公司; 温度梯度DNA扩增仪购自Biome

9、tra公司; Taq DNA聚合酶购自TaKaRa公司; 引物由上海生物工程公司测序。1.2  方法1.2.1  基因组DNA提取  抽取肿瘤患者及正常对照个体的外周血5 mL, 以ACD抗凝,使用DNA提取试剂盒从外周静脉血标本抽提基因组DNA, -20保存。1.2.2  CTLA4的1722、 CT60基因片段扩增  采用PCR方法, 用温度梯度DNA扩增仪从基因组DNA中扩增CTLA4基因中含有相应位点的基因片段。PCR反应体系为25 L, 其中基因组DNA 0.3 g, 1×PCR缓冲液, 0.3 mmol/L MgCl2,

10、0.2 mmol/L dNTPs, 2 U Taq DNA聚合酶, 上、 下游引物各0.1 mol/L。PCR反应条件为: （1）启动子区1722T/C位点PCR引物序列: 上游为5CTAAGAGCATCCGCTTGCACCT3; 下游为5TTGGTGTGATGCACAGAAGCCTTT3。PCR扩增条件: 94预变性5 min; 94 15 s, 58 5 s, 72 45 s进行30个循环; 最后72延伸7min。 PCR扩增片段为486bp。（2）转录本末端CT60G/A位点PCR引物序列: 上游为5GAGGTGAAGAACCTGTGTGTTAAA3; 下游为5ATAATGCTTCATG

11、AGTCAGCTT3。PCR扩增条件: 94预变性5 min; 94 30 s, 55.6 30 s, 72 30 s进行30个循环; 最后72延伸5 min。PCR扩增片段为178 bp。1.2.3  限制性片段长度多态性分析  PCR扩增产物分别加入限制性内切酶Bbv和HpyCH , 于37水浴16h, 20g/L琼脂糖凝胶电泳分离, 然后用溴化乙啶染色观察。1.2.4  统计学处理  采用Arlequin软件进行HardyWeinberg平衡规律计算基因型和等位基因频率, 运用统计学软件SPSS和haploview协助对单体型数据进行处理, 采用2

12、检验和Logistic回归分析计算比数比（odds ratio, OR）及其95%可信区间（confidence interval, CI）, 以P<0.05为有统计学意义。2  结果2.1  CTLA4基因1722、 CT60位点多态性酶切结果  1722位点PCR扩增片段为486bp, 1722位点经限制性内切酶Bbv 消化和20 g/L琼脂糖凝胶电泳后, 基因型T/T纯合子酶切片段为486 bp 1条带, 基因型C/C纯合子酶切片段为270 bp和216 bp2条带, 基因型T/C杂合子酶切片段为486bp、 270 bp和216bp3条带(图1)。CT60位点经限制性内切酶HpyCH 消化和20 g/L琼脂糖凝胶电泳后, 基因型G/G纯合子酶切片段为178 bp1条带, 基因型A/A纯合子酶切片段为107 bp和71bp2条带, 基因型A/G杂合子酶切片段为178bp、 107bp和71 bp3条带(图2)。2.2  乳腺癌患者和正常对照组CTLA4基因1722、 CT60基因多态性分布  经Arlequin软件检验, 乳腺患者组和正常对照组CTLA4基因1722、 CT60基因型分布符合HardyWeinberg平衡。CT60位点乳