穹窿切断并摘除肾上腺后大鼠下丘脑CRH表达变化

1、穹窿切断并摘除肾上腺后大鼠下丘脑CRHCRH表达变化作者：张彦慧，石玉秀，郑小桃，符皎荣，钟南田，洪灯(corticotropi n releasi ng hormo ne, CRH)与糖皮质激素的关系， 探讨海马参与HPA轴调节的机制。方法：建立大鼠穹窿切断模型，采用ELISA方法检测穹窿切断0、4、7、Wd血中糖皮质激素的浓度；建立大鼠穹窿切断同时摘除肾上腺7d的模型，采用免疫组织化学、免疫印迹方法检测CRH的表达变化。结果：穹窿切断7d后血中糖皮 质激素的浓度达升高。结论：海马通过穹窿对HPA轴发挥负反馈调节作用，糖皮质激素负反馈调节下丘脑CRH【关键词】穹窿切断术；穹窿切断并摘除肾上腺

2、；促肾上腺皮质激素释放激素；下丘脑（作者:单位:邮编:【摘要】【摘要】目的=观察下丘脑促肾上腺皮质激素释放激素升高，穹窿切断同时摘除肾上腺7d后，下丘脑CRH表ABSTRACT Objective: To observe the relati on betwee ncorticotropin releasing hormone (CRH and glucocorticoid and to explore themechanismof the hippocampus invoIved in HPAaxisregulati on. Methods: The fornix was tran sect

3、ed to establish a animal model , ELISAwas used for detection of glucocorticoid concentrationson day 0, 4, 7 and 10 after fornix transaction.Immun ohistochemical method and Western Bio社ing wereresp ectively used for the exp ressi on of CRHn the hypo thalamus afterGlucocorticoid concentration wasincre

4、ased on the 7th day after fornix transection.The expression of CRHwas up扌以regulated ontran secti onand ad re nalectom yon.Con clusi ons: The hippocampus provides a n egative feedback to theHPAaxis through fornix , the glucocorticoid has a negative feedback effect on CRH.KEY WORDSFor nix tran secti o

5、n; For nix tran secti onandad re n alectomy;Corticotr op in releas ing horm one;Hypo thalamus应激反应是以下丘脑拟垂体拟肾上腺（hypothalamic拟pituitary拟.adrenal, HPA）轴的激活为核心的生理releasing hormone,CRH在HPA轴中发挥重要作用,控制着HP為由的兴奋水平1。研究表明海马对HPA轴有负反馈调节作用，可能是因为fornixtran secti on and ad re n alectomy.Results;the 7th day after for

6、nix和心理反应。应激后促肾上腺皮质激素释放激素(corticotro pin海马媒介穹窿对下丘脑室旁核产生了抑制作用。本课题组前期实验 通过建立大鼠穹窿切断模型，观察到穹窿切断7d后，下丘脑室旁核神经元CRH的表达升高，10d升高显著2, 3 O此结果提示我们，穹增多,HPA轴活动增强。但是血中糖皮质激素的浓度升高是否是HPA轴活动增强的结果，这一点还未曾证实。本实验建立大鼠穹窿切断模型, 检测糖皮质激素浓度变化情况，以进一步验证海马是否媒介穹窿 对下丘脑 室旁核产生了抑制作用。 此外通过实施穹窿切断术同时摘除其肾上腺， 观 察CRH的表达变化，研究糖皮质激素与CRH的关系，为 研究揭示应激

7、 的变化机理提供一定的理论和实验依据。1材料和方法1.1动物及分组成年健康雄性Wistar大鼠90只，200220g,购于中国医 科大学实验动物中心，实验室条件饲养，随机分为12组，即穹窿切 断0、4、7、Wd组、相应假手术组和相应正常组，每组5只，共60只，用于ELISA检测。剩余大鼠随机分为穹窿切断并摘除肾上腺7d组、相应假手术组和相应正常组。每组10只，共30只，用于免疫组 织化学和免疫印 迹法各半。1.2实验方法1.2.1穹窿切断动物模型窿切断后海马对下丘脑室旁核的抑制作用减弱,室旁核合成CRH将大鼠用戊巴比妥麻醉后，固定于江湾IC型脑立体定位仪，常规消毒、剪毛，正中切开头皮，暴露出颅

8、骨，于前冈后1 5mm中线 外 左右1 0mm处，用电动开颅器凿开颅骨，切开硬脑膜，自制的双刃刀置 于上述部位的脑表面（相当于穹窿部位）,续降刀6mm切断穹窿，降刀 时间约1 mg假手术组降刀2mm（未切穹窿）,刀在脑中均 停留5mino清洁颅面，缝合头皮，常规饲养，抗生素控制感染4。1.2.2穹窿切断并摘除肾上腺模型建立穹窿切断动物模型后，将大鼠俯卧位固定于蛙板上。从最后胸椎处向后沿背部正中线做约2cm长的皮肤切口。在肾前内侧脊柱下 方找 到淡黄色的肾上腺并摘除，同法摘除右侧肾上腺（位置稍靠前），缝合肌肉和皮肤，并涂以碘酊。假手术组进行与实验组相似的手术，但不摘除代替饮水5。1.3 ELIS

9、A检测血清糖皮质激素水平取穹窿切断大鼠眼窝静脉丛血液，每次米血0 5mL,消毒棉球压迫眼球止血30S。采血后离心取血清，相应反应板孔中加入20卩L标 准品，20卩L血清标本，每板孔再加入200卩L酶联物，室温60mino洗涤液洗涤反应板，每孔加入100卩L显色液，室温温育15mino每孔 加入100卩L终止液。轻轻混匀30s； 60min内450nm处读OD值，再换算成质量浓度。肾上腺。术后保持室温为2125C,以葡萄糖、生理盐水1.4免疫组织化学SABC法显色穹窿切断并摘除肾上腺大鼠施心灌流、 固定， 用恒冷箱切片 机（型号Leica ）制作冷冻切片，厚14卩m 3%H2O2甲醇20minv

10、 0,03% TritonX拟100浸泡10min, 5% BSA封闭20min后，滴加CRH抗体（工作浓度为1:500）,阴性对照组 加0 01 mol/L PBS代替一抗，4C孵育过夜，滴加二抗IgG 37Cv 20min,滴加SABC37C、20min, DAB显色，脱水， 透明，中性树胶封片，光学显微镜（OLYMPUS3X60, Japan）下观察，摄片。1 5免疫印迹法取穹窿切断并摘除肾上腺大鼠新鲜下丘脑组织经匀浆、超声粉碎后高速低温离心,11000 r/min,取上清；每例标本提取蛋白50卩g, 7.5%SDS以PAGE变性凝胶电泳，浓缩胶80V, 30min,分离胶120V, 9

11、0min：转印，40V, 95min和100V, 120inin； TBS浸泡10min, 5%兑脂奶粉封闭60min, TTBS中洗2X 5min：TTBS洗2X5min, TBS洗1X Wmin,扫描胶片，Scion Image软件分析。CRH-抗（工作浓度1 :1000）中孵育4C过夜；HRP标记IgG（工作浓度1 : 1500）孵育2h,HRP： ECL法显色,dH2O漂洗，1.6统计学处理所得实验数据以士S表示，用SPSS13.0软件处理，采用方 差分析进行两两比较，以P0.05为有统计学意义。2结果2.1 ELISA检测结果ELISA结果表明穹窿切断后0、4d,糖皮质激素的浓度无明

12、显变化，7d后糖皮质激素浓度升高，Wd升高显著(表1)。表1各 组大鼠血清糖皮质激素的水平(略)2.2 CRH免疫组织化学反应显色结果正常组及假手术组CRH免疫反应阳性产物呈棕黄色斑块状，主要分布于室旁核神经元的细胞质内。 穹窿切断并摘除肾上腺组下丘 脑室旁 核神经元CRH的阳性表达(0,499 0,077 )较正常组(0.387 0.065 )、假手术组(0.379 0.082 )明显增高，CRH免疫反应的平均光密度值升高，细胞染色变深，(PV 0.05)(图1)。2.3免疫印迹法结果免疫印迹法检测发现下丘脑CRH的表达在穹窿切断并摘除肾上腺组(91.21士8.73)与假手术组(43.83

13、4.16 )、正常组(39,72士3.48 )相比明显升高(PV 0,05 )(图2)。3讨论CRH是一种重要的神经递质，与机体的内分泌、代谢、心血 管功能、神经化学和行为反应密切相关。CRH广泛表达于中枢神经系 统,HPA轴活动的直接控制部位。应激状态下，室旁核分泌CRH经正中隆但在应激后仅在下丘脑室旁核表达增加6。下丘月凶室旁核是起、垂体门脉系统作用于垂体前叶细胞上高度表达的CRHR1 (CR的丨型受体)，刺激垂体前叶合成、分泌ACTH促进肾上腺皮质分泌糖皮质激 素，发挥神经内分泌功能7。研究表明海马对HPA轴有负反馈调节作用。但是从海马到室旁核没有直接的神经投射，间接路径都汇聚到穹窿，由

14、此可推断海马 对HPA轴的调节作用可能是媒介穹窿对下丘脑旁核产生了抑制作用。本课题组的前期实验通过建立大鼠穹窿切断的模型，观察到穹窿切断7d后,CRH的表达升高。提示穹窿切断后，海马对HPA轴的抑制作用 减弱， 室旁核合成CRH增多，HPA轴活动增强，证明了海马可能通过 穹窿对 室旁核发挥抑制作用。但是CRH表达升高，HPA轴活动增强的最终结果 是糖皮质激素的水平升高。为此，本实验在已有的研究基础 上建立了大 鼠穹窿切断的模型，检测血中糖皮质激素的浓度，实验结 果表明穹窿切断7d后，糖皮质激素的浓度升高，进一步验证了海马 通过穹窿对下丘脑室 旁核发挥抑制作用。现将穹窿切断的动物并摘除肾上腺，即

15、在糖皮质激素水平下 降的情况下，观察CRH的表达变化。实验结果表明，穹窿切断并摘除肾上腺7d,CRH的表达升高。有研究表明当糖皮质激素的水平过高时，此激素的释放8。综上结果表明糖皮质激素对CRH有负调节的作用。本实 验为探讨海马抑制HPA轴的机制及研究应激的变化机理提供了一定能通过在下丘脑室旁核及其上游水平的调节而有效抑制CRH的实验依据。【参考文献】1 Preil J, Muller MB, Gesing A, et al. Regulation ofthe hypo thalamic pituitary jadre no cortical system in mice deficie nt

16、 forCRHeceptors 1 and 2 J . Endocrinology, 2001, 142 (11): 4946拟4955,2 Fang H, Hong L, Yanhui乙et al.hippoca扌以mpal corticosteroid receptors, as well as corticotroph in扌以releas ing horm one and vasopress in in the hy pothalamic paraventricular nucleus,in fornix transected ratsJ Neural Regeneration Rea

17、rch , 2009, 4:325拟332,3张彦慧，韩芳，石玉秀大鼠海马神经元核受体拟盐皮质激素受体于穹窿切断后表达的变化J解剖学杂志，2008,31 (4): 522拟525,4张彦慧，石玉秀，符皎荣，等大鼠海马神经元核受体拟.糖皮质激素受体在穹窿切断同时摘除肾上腺后表达的变化J神经解剖学杂 志，2010, 26 (2) : 161拟164,Expression of5张彦慧，符皎荣，陆平肾上腺切除后大鼠下丘脑室旁核MRGF表达变化的研究J海南医学院学报，2008,4(2) : 0期107.6 Imaki T, Katsumata H, Miyata M, et al,Expressi on ofcorticotroph in releas ing horm one type 1 receptor in parave ntricular nuJ .Neuroendocrinology, 2001,73:293拟301.7Fang Han. Colocalizationreceptor and gluc