稻瘟病抗性基因Pi_1连锁SSR标记的筛选和应用

1、福建农林大学学报(自然科学版)JournalofFujianAgricultureandForestryUniversity(NaturalScienceEdition)第34卷第1期2005年3月稻瘟病抗性基因Pi21连锁SSR标记的筛选和应用陈志伟,官华忠,吴为人,周元昌,韩庆典(福建农林大学作物科学学院,福建福州350002)摘要:根据稻瘟病抗性基因Pi21(,获得在抗性供体亲本(LAC23)与受体亲本(珍汕97B、金山B21和金山S21)SSR标记MGR4766,它与Pi21的遗传距离仅为1.3cM;R90%以上,而MRG4766对Pi21选择的准确率为98%-100%;Pi21选择的

2、准确率高达100%.关键词:;Pi2+中图分类号:.1文献标识码:A文章编号:100627817(2005)01200742043ThescreeningofmarmarkerscloselylinkedtoriceblastresistantgenePi21andtheirapplicationCHENZhi2wei,GUANHua2zhong,WUWei2ren,ZHOUYuan2chang,HANQing2dian(CollegeofCropScience,FujianAgricultureandForestryUniversity,Fuzhou,Fujian350002,China)A

3、bstract:AccordingtothepublishedpositioninformationofPi21geneonthephysicalmapandtheSSRgeneticmapofrice,aSSRmarkersMRG4766,whichshowedpolymorphismamongresistantdonorparent(LAC23)andrecipientparents(Zhenshan97B,Jins2hanB21andJinshanS21),wasobtained.Themarkerwerecloselylinkedtothericeblast2resistantgene

4、Pi21withadistanceof1.3cM.Thevalidationofcorrectnessrateofmarker2assistedselectionindicated,thecorrectnessrateofselectionforPi21usingSSRmarkerRM224wasover90%,andthatofMRG4766was98%to100%.Thecorrectnessratecouldreach100%whenRM224andMRG4766wereusedsimultaneously.Keywords:marker2assistedselection;ricebl

5、ast;Pi21gene;resistantbreeding水稻是全世界最重要的粮食作物之一.我国是世界上年产稻谷最多的国家.近年来,全国杂交水稻年种植面积约1533.33万hm,约占水稻总面积的50%,而产量则占水稻总产的近60%21.但是,随着杂交稻和高产栽培措施的推广,杂交稻稻瘟病等病害呈不断加重的趋势,已成为水稻生产的主要障碍.实践证明,选育和推广抗病新组合是防治水稻稻瘟病最经济有效的方法.但目前生产上大面积应用的杂交稻组合稻瘟病抗性普遍偏差,严重影响了杂交稻增产潜力的发挥.传统的水稻抗病育种依赖于抗性鉴定和植株表型的选择,要求丰富的经验和长达数年甚至十几年的时间,并且受有无合适的病菌

6、菌株和病菌发病条件的限制,鉴定结果容易造成误差,甚至造成抗性基因的2丢失,因此选择效率较低.因此,如何快速选育出抗病的杂交稻新组合是广大育种工作者面临的主要问题之一.分子标记辅助选择(marker2assistedselection,MAS)是基因组研究在育种中的直接应用,它是通过分析与目标基因紧密连锁的分子标记的基因型来对目标基因进行选择因素的影响,故选择结果可靠性高43,因其不受其它基因效应和环境.因此,MAS技术是未来水稻抗病育种发展的主要方向之一.76的长臂末端,与RFLP标记RZ536的距离为11cM;Mewetal将其定位于RZ536与NPB181之间,距离分别为7.9和3.5cM

7、.但是,这些标记多数是RFLP标记,不易在育种中直接应用.微卫星(亦称简单序列重复,SSR)是新一代的分子标记,它不仅数量丰富、多态性高,而且只需用常规的PCR方法进行检测,操作简便,结果可靠,因此是标记辅助育种较理想的分子标记.收稿日期:2004-11-05修回日期:2005-01-04基金项目:国家“863”计划资助项目(2004AA211141);福建省科技厅资助项目(2000Z026);福建省教育厅资助项目(JA03064).作者简介:陈志伟(1973-),男,助理研究员,博士.研究方向:水稻遗传育种、作物分子标记辅助育种.3通讯作者.第1期陈志伟等:稻瘟病抗性基因Pi21连锁SSR标

8、记的筛选和应用75本试验在前人研究的基础上,筛选与稻瘟病抗性基因Pi21紧密连锁的SSR标记,为利用MAS技术将该基因导入优良的杂交稻亲本提供条件.1材料与方法1.1供试材料抗性供体亲本:LAC23来自利比亚的粳型品种,携有Pi21基因;抗性受体亲本:97B(目前生产上累计应用面积最大的保持系,配合力好、适应性广)、金山B21(,为国内首个垩白率和垩白度均为0,且12)S21(本研究室新育成的优质、低温敏两用不育系,配合力好、.1.2目标基因连锁标记的筛选方法,网站上直接查找它们SSR标记,SSR标记直接在亲本间筛选多态性标记.1.3SSR2+的方法.

9、20L的PCR反应体系含2L10×Buffer(不含Mg)、2L-1-1-1MgCl2(25mmolL)、0.3LdNTP(10mmolL)、10molL引物各2L、1单位Taq酶、40ng模板DNA.PCR反应条件为:94变性30s,53复性1min,72延伸1.5min,35个循环.产物通过聚丙烯SSR分析参照段远霖等8酰胺变性凝胶电泳,用银染法显带.1.4MAS选择效果评价把通过MAS技术选出的单株(BCF1)的自交种(包括LAC23×珍汕97B的BC3F2、LAC23×金山B21的BC2F2和LAC23×金山S21的BC2F2)以及抗感对照品种按

10、株系种植于福建省上杭县茶地乡稻瘟病重发区进行自然诱发鉴定,以自交种的抗性表现来推断上一代各单株的抗性表现.鉴定材料于2003年6月20日播种,7月23日插秧.设2个重复,以发病重的重复为最终定级标准.鉴定株系(包含抗、感对照品种)与诱发品种相间排列,每个株系插4行,每行7株.栽培过程中偏施N肥,周围种植感病品种诱发发病.抽穗后抗病对照和感病对照抗感差异达极显著时,统计各株系(BCF2)穗颈瘟抗感分离情况,确定各株系的前一世代(BCF1)的抗感反应.2结果与分析2.1抗稻瘟病基因Pi21的连锁标记的获得刘士平等报道,Pi21位于SSR标记RM144和RFLP标记RZ536之间,与它们的距离分别为

11、6.8和9.7cM.所以,本研究利用RM144和谱(GrameneTIGRPseudomoleculeAssembly,2003)上的位置,发现RM144和RZ536分别位于水稻第11号染色体的24649000-24649224bp和24777270-24778184bp处,并在它们所在的区域附近找到7个9已定位于该区段的SSR标记.从中选取3个标记(MRG4923、MRG47661-4:RM224的扩增产物;5-8:查得这3个标记的引物序列.MRG4766的扩增产物,亲本排列依次为最后,利用已报道的与Pi21连锁较紧密的SSR标记引物RM144、LAC23、珍汕97B、金山B21和金山S21

12、.RM224和网上查找获得3对SSR引物在LAC23和各受体亲本间检测图1RM224和MRG4766在亲本多态性,发现只有RM224和MRG4766的扩增产物在LAC23与各受体间扩增产物多态性表现Fig.1ThepolymorphismofRM224and亲本间表现出多态性(图1),它们的引物序列如表1所示.MRG4766amongparents76表1亲本间有多态性的引物福建农林大学学报(自然科学版)第34卷Table1Theprimerswhichshowpolymorphismamongparents抗病基因Pi21Pi21标记名称RM224MRG4766引物序列(F)5-ATCGAT

13、CGATCTTCACGAGG-3(R)5-TGCTATAAAAGGCATTCGGG-3(F)5-ATTGCTGCAAAGTGGGAGAC-3(R)5-AAGTGGAGGCAGTTCACCAC-3BAC克隆-AC137064SSR序列位置-45957-bp重复序列(AAG)8(AG)13(AGA)92.2SSR标记在物理图谱和遗传图谱上的位置fcgi?d上下载RM144-RZ536的基因组序列和,并在/blast/bl2seq/bl2.ht2程序进行比较,确定MRG4766在RM144-RZ536的位置,结果如图2.图2Pi21基因区域的物理图

14、谱和遗传图谱9根据刘士平等的定位结果,Pi21与RM144和RZ536距离分别为6.8和9.7cM,而RM224与RM144间距为5.7cM.由此可以估算出,Pi21与RM144和RZ536间的物理距离分别为57和72kb(图2);而本研究获得的SSR标记MRG4766与Pi21的物理距离仅10kb,换算成遗传距离也仅为1.3cM.由此看来,MRG4766与Pi21间的距离非常近,可以满足MAS对标记选择准确率的要求.2.3Pi21基因的MAS效果评价表2Pi21基因的MAS选择准确性本研究在回交过程中利用Fig.2ThephysicalmapandgeneticmapofPi21genere

15、gionRM224或MRG4766对Pi21进Table2TheconsistencyofPi21usingmarker2assistedselectionBCF1的标BCF2的株55(BC3F2)38(BC2F2)42(BC2F2)51(BC3F2)34(BC2F2)39(BC2F2)50(BC3F2)行选择,并从中选单株的自交后代的抗性表现来判断MAS选择的准确率.利用标记对Pi21基因选择的准确性评价如表2所示.从表2可以看出,在3个不同的群体中,利用RM224对Pi21进行选择的准确率为90.5%-92.1%,3个群体中选择的标记RM224杂交组合LAC23×珍汕97BLAC

16、23×金山B21LAC23×金山S21抗感分离全部感病的株系数5341000选择的准确率/%记基因型系数及世代的株系数AaAaAaAaAaAaAa50353850343950MRG4766LAC23×珍汕97BLAC23×金山B21LAC23×金山S21RM224LAC23×珍汕97B准确性差别不大.但总的来看,利用该标记对Pi21选择的准确率可达90%以上,基本可以满足育种的要求;而利用MRG4766对Pi21进行选择的准确率为98%-100%,在3个群体中选择的准确性差别也不大,但选择的准确性比RM224高,这与该标记与目标基因的

17、遗传距离较近有关;同时利用RM224和MRG4766对Pi21进行选择的准确率高达100%.表明利用目标基因两侧紧密连锁的分子标记同时对目标基因进行选择的准确率是非常高的,该结果与我们推断的遗传距离是相符合的(同时利用两标记对Pi21进行选择第1期陈志伟等:稻瘟病抗性基因Pi21连锁SSR标记的筛选和应用77的理论值为120.068×0.013=99.9%).但由于在MAS效果评价时群体不大(均小于60个株系),MRG4766和RM224对目标基因选择的准确率还有待进一步验证.3讨论随着水稻全基因组测序工作的完成和公布,人们可以根据已有的与目标基因紧密连锁的分子标记的序列进行染色体登

18、陆,快捷地得到目标基因所在区段的序列,然后在该区段查找,从而可以快速准确地找到与目标基因紧密连锁的SSR标记.但是,SSR,而且新设计出的引物不一定都会有扩增产物,.如本课题组在筛选与Pi21基因连锁标记时曾设计了6对引物,3对在亲本间没有扩增出多态性片段,均不成功.,也可以用已公布的SSR标记,根3000对SSR引物,平均10,11每157kb就有1个SSR.这样,利用这些标记及目标基因在水,SSR标记.这种方法应该是目前获得SSR.本研究中,我们利用这种方法获得了一个与Pi21紧密连锁的SSR标记MRG4766.9记MGR4766,比刘士平等筛选到的SSR标记RM144近5.5cM,利用该

19、标记对Pi21进行跟踪选择将具有9更高的准确率.该结果在我们的MAS准确性评价中得到证实.另外,通过分析刘士平等的定位结果和该区域各个标记在水稻基因组物理图谱上的位置,我们可以估算出MGR4766与RM224位于Pi21的两侧,若以这两个标记同时进行选择,它们对目标基因选择的准确率预计将达99.9%以上,该结果也在我们的MAS准确性中得到验证.本研究在确定MRG4766与Pi21的物理距离和遗传距离是根据前人定位的图谱近似推断得来的,由于目标基因与标记间的重组率在不同的群体中有一定的差异,故该结果与实际的物理距离和遗传距离会存在一定的误差,但是这种误差对评价MAS的选择准确性不会有太大的影响.参考文献:1袁隆平.我在杂交水稻方面所做的工作J.中国科技奖励,2001,9(1):14-19.2危文亮,赵应忠.分子标记在作物育种中的应用J.生物技术通报,2000,(2):12-16.3郑康乐,黄宁.标记辅助选择在水稻改良中的应用前景J.遗传,1997,19(2):40-44.4倪新强,王忠华.分子标记辅助选择及其在水稻育种中的应用J.中国农学通报,2001,17(3):58-61.5CHENHL,CHENBT,ZHANGDP,etal.Pathotypesofpyricularagriseainricefieldsofcentralandsouthern