浅议耐受CD4~+Foxp3~+Tregs在慢性HBV感染中的作用及其抗原特异性论文

1、浅议耐受CD4+Foxp3+Tregs在慢性HBV感染中的作用及其抗原特异性论文    摘要：乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）属于嗜肝非细胞病变的DNA病毒，据估计全世界感染HBV者达3.5亿人之多，每年大约有一百万人死于HBV感染相关性疾病。在急性自限性HBV恢复者体内检测到活跃的多克隆、HBV特异性的CD4+和CD8+T细胞应答。相反，慢性HBV患者中仅观察到微弱的病毒特异性T细胞反应。但究竟是什么理由导致了慢性HBV患者体内的抗病毒免疫应答低下，目前还不完全清楚。目前认为慢性HBV感染中的高病毒抗原载量、肝脏的耐受环境、专

2、职抗原提呈细胞损坏和CD4+Tregs等因素都对机体的免疫耐受起着重要的作用。CD4+CD25+Tregs在诱导外周耐受和防止自身免疫病中发挥着关键的作用。许多探讨也表明CD4+CD25+Tregs也在调节特异性抗病毒免疫反应中起着重要作用。近年来报道CD4+CD25+Tregs与HBV感染的慢性化相关，且用HBV抗原刺激慢性HBV患者的PBMC能诱导CD4+CD25+Tregs。可是，由于活化的T细胞也会高表达CD25和Foxp3，由此用CD25和/或Foxp3作为标记来探讨Tregs并不科学，特别是探讨有持续病毒抗原刺激的患者，其外周的CD4+CD25+T或CD4+CD25+Foxp3+T

3、细胞必定是Tregs和最近活化的效应T细胞的混合物。最近，Miyara等报道人的CD4+Foxp3+T细胞可分为三个表型和功能不同的亚群：CD45RA+Foxp3lo(CD25+)静息态细胞rTregs (resting Tregs，rTregs)，Foxp3hiCD45RA-(CD25+)活动态细胞aTregs (activated Treg，aTregs)和FoxploCD45RA-(CD25+)non-Tregs (non-Tregs)，他们的探讨结果表明这三个亚群能很好地评价不同生理和病理情况下Tregs的分化动力学。由此，我们很有必要对慢性HBV感染中CD4+Foxp3+Tregs的

4、作用和地位重新进行探讨。基于此目的，我们首先按照Sakaguchi探讨组的探讨策略，根据Foxp3和CD45RA标志的不同，把慢性HBV患者外周血和肝组织中CD4+Foxp3+T细胞分为三个不同的亚群：rTregs，non-Tregs和aTregs，并检测了这三个亚群CTLA-4, HLA-DR和Ki67表型分子的表达，以及IFN-, IL-2和IL-17A炎症因子的分泌。探讨结果表明：在慢性HBV*本探讨受到国家自然基金项目(NO.30872352)和国家科技重大专项课题“重大新药创制”(No.2009zx09503-005)资助发病机制中，aTregs是关键的免疫抑制分子，同时慢性HBV患

5、者外周血中CD4+Foxp3+T细胞分为三个不同的亚群后，其表型、增殖地位和细胞因子分泌均与Sakaguchi组的探讨结果一致。此外，我们通过流式细胞术浅析了健康者、AsCs、CAH和ACLF患者的外周血和肝组织中CD4+Foxp3+T细胞的三个不同亚群和CD4+CD25+Foxp3+T细胞频率。与健康对照相比，AsCs、CAH和ACLF患者的CD4+CD25+Foxp3+T细胞频率都显著上调表达。而同样条件下，把AsCs、CAH和ACLF患者外周血中CD4+Foxp3+T细胞分为三个不同的亚群后，在不同慢性HBV感染状态下，患者的外周血和肝组织中这三个亚群有不同的分布特点。与AsCs和健康对

6、照相比，ACLF和CAH患者的外周血和肝组织中aTregs频率都显著地上调表达，且aTregs与HBV DNA载量强烈相关，而与肝损伤和TGF-1不相关，这表明增加的aTregs可能抑制了抗-HBV的免疫反应，这样有利于HBV的复制，但是aTregs对于慢性HBV感染中肝损伤的保护作用并不大。而与AsCs和CAH患者相比，ACLF患者的外周血和肝组织中CD4+CD25+Foxp3+T细胞表达最高，但增加的CD4+CD25+Foxp3+T细胞中，以增加分泌IFN-、IL-2和IL-17A等炎症因子的non-Tregs为主，而不是aTregs。肝活检结果也说明了肝损伤的严重程度与non-Tregs

7、显著相关，进一步说。    明了non-Tregs确实加重了肝损伤。既然在炎症局部Tregs的活化、增值、滞留甚至抑制功能的发挥都依赖特异性抗原，我们进一步对抗原特异性的活动态的Tregs进行了探讨。我们发现HBcAg来源的肽刺激HBeAg阳性患者的PBMC后，不同患者的CD4+CD25+Foxp3+T细胞上升的频率也不同。有趣的是，对于含有HLA-DR9等位基因的CAH患者，肽HBcAg81-105能优先诱导CD4+CD25+Foxp3+T细胞和aTregs细胞亚群。肽HBcAg81-105诱导的Tregs抑制功能的发挥需肽特异性的激活，同时HBcAg

8、81-105肽诱导的CD4+Foxp3+Tregs具有DR9限制性。这些结果暗示了在HBV感染的肝组织中，HBcAg来源的肽配体可能对于CD4+Tregs的激活、增值和滞留发挥着关键作用，如果HBV特异性活化的Tregs与效应CD4+或CD8+T细胞识别相同的抗原，Tregs对这些效应细胞的抑制作用可能更有效。本探讨根据Foxp3和CD45RA标志的不同，将慢性HBV患者外周血和肝组织中CD4+Foxp3+T细胞分为rTregs，non-Tregs和aTregs，这三个亚群比CD4+CD25+Foxp3+T细胞能更好地区分不同的慢性HBV感染状态。我们也提出HBcAg来源的肽可能在激活CD4+

9、Tregs中发挥重要作用，以及这些HBV抗原激活的CD4+Tregs可能在制约抗HBV免疫反应比制约肝损伤更有效，这对于理解慢性HBV感染中Tregs的产生机制和作用提供了新的视野。    关键词：Tregs亚群论文 慢性HBV感染论文 HBcAg论文 调节性T细胞论文 免疫耐受论文         英文缩写一览表6-9Abstract9-12摘要12-14前言14-16第一部分 慢性 HBV 患者外周血的 CD4+Foxp3+T 细胞分群浅析16-52前言16-18第一节

10、慢性 HBV 患者外周血中 CD4+Foxp3+T 细胞三亚群表型和细胞因子浅析18-31材料与策略18-21结果21-28讨论28-31第二节 健康者、AsCs、CAH 和ACLF 患者的PBMC 和肝组织中rTregs、aTregs、nonTregs 和 CD4+CD25+Foxp3+T 细胞频率特点及临床指标相关性浅析31-46材料与策略31-36结果36-42讨论42-46参考文献46-52第二部分 在慢性HBV 感染中CD4+Foxp3+Tregs 的抗原特异性浅析52-93前言52-53第一节 各候选的 Tregs 表位的合成、纯化与鉴定53-61材料和策略53-54结果54-60讨论60-61第二节 HB