噬菌体表面表达人干扰素αlc86D

1、    噬菌体表面表达人干扰素lc/86D        【摘要】目的为今后干扰素lc/86D突变体文库的建立和筛选高活性的新型干扰素分子打下基础。方法利用phage display技术表达人IFNlc/86D基因。结果酶联免疫吸附试验、点杂交和Western blot 均证明重组噬菌体颗粒具有干扰素的免疫反应性，生物学活性测定表明，当重组噬菌体为5×1010TU时，与4IU的重组IFNlb活性相当。结论人IFNlc/86D在噬菌体表面能正确折叠和功能性表达。【主题

2、词】噬菌体干扰素酶联免疫吸附测定Western blotFunctional phage display of human interferon alpha 1c/86D Ma Xuejun,Hu Rong,Lu Hai,et al.State Key Laboratory for Molecular Virology and Genetic Engineering,Beijing 100052AbstractWe have successfully displayed human interferon-lc/86D(IFN-lc/86D)on the surface of the filam

3、entous bacteriophage using a phagemid vector syetem (pCANTAB5E).The IFN-lc/86D cDNA was fused to a DNA sequence encoding the amino-terminal domain of p,a minor coat protein exposed at one end of the phage.Fusion gene wase packaged into phagemid particles upon superinfection with M13K07 helper phage.

4、Expression of IFN-lc/86D was verified by its reactivity with IFN-l specific neutralizing antibodies and the phage displayed IFN-lc86D was found to possess antiviral biological activity on VSV challenged WISH cells comparable to that of human recombinant IFN-lb.These results demonstrate that IFN-lc/8

5、6D can be displayed on phage in a correctly folded and functionally active form,and this system can be applicable to the sorting of a large repertoire of phage-displayed IFN-lc/86D variants.Key words:Phage displayInterferonWestern blotEnzyme-linked immunosorbent assay.噬菌体表面呈现(phage display)技术是由Smith

6、1于1985年建立起来的，其基本原理主要是利用某些单链丝状噬菌体如M13、fd等感染的可分泌特性，以及将外源基因插入这些噬菌体外膜蛋白P和P基因的末端构成融合蛋白时，既不影响噬菌体的感染特性，同时保留外源基因产物的结构和生物学功能的性质，使外源基因在噬菌体表面有效表达。这种表达系统的最大优点在于将在大肠杆菌体内表达的外源基因产物有效地转移到了膜上进行直接研究，另外由于单链噬菌体的可分泌性，在培养细菌的上清中可获得大量扩增的噬菌体颗粒，只需一次简单的沉淀便可富集得到含外源基因产物的重组噬菌体颗粒，这对于某些在大肠杆菌内表达不稳定的外源基因不失为另一种可供选择的系统。噬菌体表面呈现技术广泛用于肽库

7、和抗体库的研究，在细胞因子应用方面，h-GM2，IL-33，IL-64，CNTF5，6，IL-27等都成功地获得表达，这项技术的成功之处在于它引申出了一个分子库(molecular repertoire)的概念，理论上只要找到一个合适的筛选方法，就可以筛选到任何一个或几个重组的噬菌体，带有所需的抗体，基因产物或短肽。我们利用phage display 技术成功地表达了人IFNlc/86D基因。1材料和方法菌株、载体和引物大肠杆菌TG1和表达载体pCANTAB5E购自Pharmacia公司质粒pE1028含IFNlc/86D cDNA由本实验室构建，PCR两侧引物P1：5'-CGCTGG

8、CCCAGCCGGCCTGTGATCTCCCTGAGACC-3'(含Sfi酶切位点)，P2：5'-TGACGCGGCCGCTTCCTTCCTCCTTAATCT-3(含Not I酶切位点，去除了终止密码子)。主要试剂ECL检测试剂盒为Amersham公司产品；IFNlb为深圳科兴产品；抗IFN1中和抗体4C1和3E9由安微安科公司惠赠；DNA序列分析试剂盒由美国ABI公司提供；HRP标记的抗M13多抗和辅助噬菌体M13K07为Phamarcia公司产品。96孔酶标板为Nunc公司产品。人传代羊膜细胞(WISH)和滤泡性口膜炎病毒(VSV)由病毒基因工程国家重点实验室保存并提供。T

9、aq酶、dNTP和PCR反应缓充液购自Promega公司；氯化铯购自华美生物工程公司。550型酶标仪为Bio-Rad公司产品。重组噬菌体的构建以质粒pE1028为模板，用两侧引物P1和P2进行PCR反应。反应参 数为941分种。551分种，721分种，获取IFNlc/86D cDNA,用Sfi和Not酶切后，插入经Sfi/Not消化的pCANTAB5E载体，转化受体细胞TG1，30培养过夜。在SOBAG板(100g/ml氨苄青霉素，2%葡萄糖)，上随机挑取10个克隆，PCR鉴定9个阳性。其中1个阳性克隆经DNA序列测定证实。噬菌体干扰素的制备和纯化阳性克隆30过夜培养后，1：10转4ml 2&

10、#215;TYAG37培养至对数中期，加入5×109PFU/ml辅助噬菌体M13K07，37感染1小时后，离心去上清，转400ml 2×TYAK(100g/ml卡那霉素)中，3720小时，离心去细胞，PEG沉淀两次，最后溶10mlTE中，加入氯化铯至终浓度0.5g/ml,39 000r/min,15离心17小时。用5ml注射器取出噬菌体带。在500mlTE(pH8.0)和500mmol/L NaCl溶液中4透析过夜，加入0.02%NaN3 4保存。测269nm的A值，定量为1.8×1013噬菌体颗粒/ml。病毒粒子的浓度可从以下公式获得：颗粒数/ml=A269&#

11、215;6×1016/单链DNA的碱基数8。噬菌体干扰素的ELISA、免疫点杂交和Western印迹实验用ELISA测定噬菌体干扰素的免疫学性质。包被抗IFNl单克隆抗体4C1和3E9各g,4过夜，次日1%BSA/PBS封闭2h，50l重组噬菌体约5×1010TU混和50l BSA/PBS 2h后，加入包被孔中，37反应2h，充分洗涤后，加入HRP标记噬菌体多克隆抗体，经OPD(邻苯胺)显色，492nm测A值。2×1010TU重组噬体菌在12%PAGE-SDS电泳，50V lh转PVDF膜，参照ECL试剂盒说明书检测干扰素基因的表达。2×109TU重组噬

12、菌体的点杂交类似用ECL检测。噬菌体干扰素的生物学活性测定在VSV-WISH系统上用细胞病变抑制法(CPE)测定噬菌体干扰素的生物学活性9。人传代羊膜细胞(WISH)和滤泡性口膜炎病毒(VSV)由本室保存并提供。用重组干扰素lb(深圳科兴公司，3百万国际单位/ml)作对照，噬菌体干扰素和对照干扰素均倍比稀释，结果用结晶紫显色，酶标仪测540nmA值。2结果重组噬菌粒载体pCANTAB5E/IFN1c/86D的构建通过常规的PCR反应和酶切消化，将IFNlc/86DcDNA克隆至pCANTAB5E载体，构建了重组噬菌体载体pCANTAB5E/IFNlc/86D(1)1重组噬菌粒载体简Constr

13、uction of recombinantd pCANTAB5E/IFNlc/86D重组噬菌体干扰素的免疫学性质ELISA结果表明(2)，它与抗IFN1的中和抗体4C1和3E9均有明显的免疫反应性，而重组噬菌体插入对照无结合，说明IFNlc/86D已呈现在噬菌体表面。Western印迹结果表明(3)，在80kD位置有单一条带呈现，表明基因3融合蛋白与中和抗体4Cl有结合。因基因3蛋白的电泳迁移率在凝胶电泳中异常，其表现出的分子量比实际分子量偏大，故基因3融合蛋白的电泳位置滞后3，7，10。重组干扰素lb的单体和双体都和抗体4Cl作用。重组噬菌体干扰素的生物学活性4的结果表明，5×10

14、110TU重组噬菌体干扰素和4IU的重组干扰素lb2噬菌体干扰素的免疫活性Immunoreactivity of recombinant phage-IFNlc/86D to the neutralizing mAb 4Cl and 3E93讨论重组基因工程人干扰素1b是我国第一个获准进入临床的高技术新药，用于治疗肝炎和肿瘤并取得一定疗效，利用噬菌体表面呈现技术的表达和筛选优势可用于研制新一代的高效(高比活性)低毒副反应的新型干扰素。由于IFNlc在中国人中是主要的亚型变种，而IFNlb/86D的抗病毒活性高于IFNlb母体，这提示我们选择IFNlc/86D更有意义。本文构建的重组噬菌体干扰素

15、具有免疫反应性和相当的抗病毒活性，表明IFNlc/86D3重组噬菌体干扰素lc/86D的免疫印迹M：分子量标准;1：gIFNlb；2：重组噬菌体干扰素lc/86D (2×1010TU)；3：噬菌体插入(5×1010TU)Western blotting of recombinant phage-IFN1c/86DM：g IFN1b.2:Recombinant phage-IFN1c/86D(2×1010TU).3：Phage-insert control (5×10104噬菌体干扰素1c/86D的抗病毒活性a:5×1010TU噬菌体干扰素；b:

16、4IU干扰素1b； c:WISH细胞；d：VSV 对照Antiviral activity assay for recombinan tphage-IFNlc/86D on VSV challenged WISH cella:5×1010TUphage-IFNlc/86D.b:4IU IFN 1b.c:WISH cell control.d:Virus control病毒活性的分析。噬菌体载体pCANTAB5E本是应用于表达和筛选单链抗体片段(ScFv),本文结果表明这个系统也可应用于细胞因子的表达。从理论上说，1 IU(国际单位)的干扰素lb相当于3×108分子，也即4I

17、U的干扰素lb相当于1.2×109分子，而噬菌体的颗粒数一般可用TU(转导单位)表示，考虑到噬菌粒/辅助噬菌体系统表达重组分子的水平在1%10%之间3，7，绝大部分噬菌体整合的仍是野生型的基因3蛋白质，因此，5×1010TU的重组噬菌体的“有效分子数”在5×108至5×109之间，与4IU的干扰素lb的分子数相当。此外，重组基因工程干扰素lb来源于大肠杆菌系统，尽管利用pCANTAB5E系统表达时在成熟的IFNlc/86D的N端和C端都有多余的氨基酸，但干扰素的研究表明，其N端和C端对于干扰素的活性是不重要的，甚至可以缺失部分氨基酸11，因此，我们认为I

18、FNlc/86D完全可以在该系统有效地表达，这为今后利用该系统建立干扰素lc/86D突变文库和筛选高活性新型干扰素打下基础。 参考文献1Smith G P.Filamentous fusion phage:novel exprsssion vectors that display cloned antigens on the viron surface,Science,1985,228:1315-1317.2Lowman H B,Wells J A.Affinity maturation of human growth hormone by monovalent phage display.J

19、 Mol Biol,1993,234:564-578.3Gram H,Strittmatter U,Lorenz M,et al.Phage display as a rapid gene expression system:production of bioactive cytokine and generation of neutralizing monoclonal antibodies.J Mol Methods,1993,161:169-176.4Cabibbo A,Sporeno E,Toniatti C,et al.Monovalent phage display of huma

20、n interleukin-6:selection of superbinder variants from a complex molecular repertoire in the HIL-6 D-helix.Gene,1995,167:41-47.5Saggio I,Gloaguen I,Laufer R, et al.Functional phage display of ciliary neurotrophic factor.Gene,1995,152:35-39.6Saggio I,Gloaguen I,Poiana G,et al.CNTF variants with increased biological potency and receptor selectivity define a functional site of receptor interaction.EMB