大鼠结肠cajal细胞库容性Ca2+内流检测的临床价值

1、大鼠结肠cajal细胞库容性Ca2+内流检测的临床价值         10-09-03 10:33:00     作者：卢敏    编辑：studa20【摘要】  目的：通过检测大鼠结肠cajal细胞中库容性Ca2+内流(capacitative Ca2+ entry，CCE)，探讨导致大鼠结肠cajal细胞内Ca2+稳态失衡的信号途径，为治疗相关疾病提供新的思路。方法：荧光探针Fura-2/AM标记细胞内游离Ca2+后，用

2、荧光分光光度计检测乙二醇-双(2-氨基乙基醚)四乙酸(EGTA)耗竭胞内钙库后对分离的大鼠结肠cajal细胞Ca2+浓度(Ca2+)的影响。结果：在无Ca2+缓冲液中加入EGTA(10 mmol/L)，细胞内Ca2+由静息时的(69.37±3.02) nmol/L升高至(272.52±5.21 ) nmol/L;继之，向细胞外液中引入1.5 mmol/L和3.0 mmol/L的氯化钙溶液，导致细胞内Ca2+进一步升高为(466.43±4.63) nmol/L和(977.43±3.27) nmol/L;且此升高效应对维拉帕米(5 mol/L)不敏感，但可被

3、2APB(20100 mol/L)抑制。结论：酶解法并结合密度离心法分离的大鼠结肠cajal细胞上存在胞内钙库耗竭激活的Ca2+内流。这对于研究钙通道活性改变、预防和控制因胃肠动力紊乱所致的消化系统疾病具有重要意义。 【关键词】  库容性Ca2+内流·结肠cajal细胞·大鼠，Wistar【ABSTRACT】 Objective: To investigate the changes of capacitative Ca2+ entry(CCE) in colon cajal cells and its mechanism. Methods: Intracellu

4、lar Ca2+ changes induced by EGTA -activated Ca2+ influx were measured in colon cajal cells which was freshly isolated from colon of Wistar rats with acute enzymatic dissociation and ficoll density centrifugation method.with the fluorescent indicator Fura-2/AM. Results: In the absence of external Ca2

5、+, the concentration of calcium-chelating agent EGTA elevated Ca2+ from (69.37±3.02)nmol/L to (272.52±5.21)nmol/L,a subsequent reintroduction of Ca2+ into the extracellular solution resulted in further Ca2+ elevating to 466.43±4.63)nmol/L and(977.43±3.27)nmol/L respectively, and

6、the response was blocked by 2APB, but it was insensitive to L-type voltage calcium channels blocker verapamil. Conclusion: Ca2+ influx activated by store depletion are present in colon cajal cells, it has the value for further study on gastric motility disorder diseases.【KEY WORDS】 Capacitative Ca2+

7、 entry· Colon cajal· Wistar rats钙离子(Ca2+)是细胞间连接和信号传递的重要成分，影响细胞重要的生理功能。钙离子浓度(Ca2+)变化对胃肠平滑肌的收缩与舒张起着决定性作用。因此，Ca2+与胃肠动力紊乱疾病的关系引起人们越来越多的关注，成为近年研究的靶点。本研究通过检测大鼠结肠cajal细胞Ca2+内流，探讨导致大鼠结肠cajal细胞内Ca2+稳态失衡的信号途径，为治疗因胃肠动力紊乱所致的消化系统疾病提供新的思路和实验依据。1材料与方法1.1溶液与配制胶原酶、4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、乙二醇二乙醚二胺四乙酸(EGTA)、牛磺酸、二甲

8、基亚砜(DMSO)、Fura-2/AM、Triton X-100、锥虫蓝、维拉帕米以及牛血清白蛋白均购于Sigma公司。HEPES-Ringer缓冲液成分：氯化钠126 mmol/L，氯化钾6 mmol/L，HEPES 6 mmol/L，D-葡萄糖11 mmol/L，氯化镁1.2 mmol/L，氯化钙1.5 mmol/L，溶液pH值以氢氧化钠5 mol/L调至7.0。无钙缓冲液成分：氯化钠126 mmol/L，氯化钾6 mmol/L，HEPES 6 mmol/L，D-葡萄糖11 mmol/L，氯化镁1.2 mmol/L，EGTA 0.2 mmol/L。含酶细胞分离液用低钙缓冲液：氯化钙0.03

9、 mmol/L ，氯化钠126 mmol/L，氯化钾6 mmol/L，HEPES 6 mmol/L，D-葡萄糖11 mmol/L，氯化镁1.2 mmol/L，EGTA 0.2 mmol/L。Fura-2/AM以DMSO溶解，DMSO终浓度<0.1%。1.2大鼠结肠cajal细胞的分离体质量200250 g成年Wistar大鼠，雌雄不限。采用酶解法并结合密度离心法1分离结肠cajal细胞。分离出的细胞以孔径500 m的尼龙网过筛，悬浮于无钙缓冲液中。取1滴细胞悬液做锥虫蓝排斥试验，证明细胞成活率在90%以上。1.3实验分组将分离好的大鼠结肠cajal细胞随机分为4组，做不同处理。1)对照组

10、：在无钙HEPES-Ringer缓冲液中测大鼠结肠cajal细胞静息Ca2+，随后向细胞悬液中分别引入1.5 nmol/L和3.0 nmol/L的氯化钙溶液测定Ca2+。2)EGTA组：操作前先给予10 mmol/L EGTA，其他处理与对照组相同。3)EGTA+维拉帕米组：操作前先给予10 mmol/L EGTA和5 mol/L维拉帕米，其他处理与对照组相同。4)EGTA+2APB组：操作前先给予10 mmol/L EGTA和2APB(20、40、60、80和100 mol/L)，其他处理与对照组相同。1.4Fura-2/AM负载细胞及荧光测定Ca2+将上述4组细胞悬液置于透明容器中，向细胞

11、悬液中加入溶于DMSO的终浓度为5 mol/L的 Fura-2/AM溶液，37 恒温孵育30 min，常温1 500 r/min离心1 min，冲洗2次，用无钙缓冲液悬浮，在倒置显微镜下调整细胞数至109 L-1。用960 MC荧光分光光度计测定Ca2+，激发波长为340 nm和380 nm，激发波长变换时间2 s，发射波长500 nm。记录4组大鼠结肠cajal细胞给药前后荧光强度F340/F380的比值。依据Grynkiewicz公式计算Ca2+。Ca2+=Kd(R-Rmin)/Rmax-R) b，其中Kd=224 nmol/L，为Fura-2与Ca2+的反应解离常数;R=F340/F380，为不同条件下的荧光强度值。Rmax为最大荧光强度，即加入Triton X-100(终浓度0.1%)后测得的荧光强度值;Rmin为最小荧光强度，即在Rmax基础上加入EGTA(终浓度5