荧光定量PCR引物设计要求(汇编)

1、精品文档荧光定量 PCR 引物设计要求荧光定量 PCR 引物的具体设计要求：1.引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。最好位于编码区5端的300-400bp 区域内，可以用DNAman,Alignment 软件看看结果。2. 产物不能形成二级结构 (自由能小于 58.61KJ/mol)。3.引物长度一般在17-25 碱基之间 ,上下游引物不能相差太大。4.G+C 含量在 40%60%之间， 45-55%最佳。5.碱基要随机分布，尽量均匀。6.引物自身不能有连续4 个碱基的互补。7.引物之间不能有连续4 个碱基的互补。8.引物 5端可以修饰。9.3 端不可修饰，而且要避开 AT,GC ric

2、h 的区域，避开 T/C,A/G 连续结构 (2-3个 )。10. 引物 3端要避开密码子的第 3 位。11.引物整体设计自由能分布5端大于 3端，且 3端自由能最好小于9KJ/mol 。可用 oligo 6 软件进行比对看结果的情况。12.做荧光定量产物长度80-150bp 最好，最长是 300bp.13.引物设计避免 DNA 污染，最好跨外显子接头区。14.引物与非特异性扩增序列的同源性最好小于70%或者有 8 个互补碱基同源。15.查看有无假基因的存在。 假基因就是无功能的 DNA 序列，与需要扩增的目的片段长度相似。16.TM 值在 58-62 度之间。17.引物设计的软件Primer

3、 5.0 有专门针对荧光的。ATGATGTTGACCTTGTCGCGTAACGATCCGTTTATCACCACTGACTACATGACATATATGTTCAAGTATGACACTGTTCATGGACAATGGAAGCATCATGAGCTTAAGGTCAAGGATGAGAAGACTCTTCTCTT CGGTGAGAAGCCAGTCACTGTTTTTGGCATCAGAAACCCTGAAGATATCCCATGGGGTGAGGCTGGGGCTGACTTTGTGGTCGAGTCCACTGGAGTCTTCACAGACAAAGACAAAGCTGCTGCCCATTTGAAGGGTGG TGCAAAGAAAGT

4、CATCATCTCTGCTCCTAGCAAAGATGCTCCCATGTTTGTTATGGGTGTCAAC GAGAA GGAATACACACCCGAGCTTAACATTGTTTCAAATGCCAGCTGTACAACCAACTGCCTTGCTCCCTTGGCCAAGGTCATAAACGACAGGTTTGGCATTGTTGAGGGTCTTATGACAACTGTGCACGCTATGGCTGCCAC TCAAAAGACTGTTGATGGTCCATCAATGAAGGACTGGAGAGGTGGAAG精品文档精品文档5'GAGAAGGAATACACACCCGAGC 3'5'GACCA

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7、ACAGTCTTTTGAGTGGCAG3'精品文档精品文档5'GAGAAGGAATACACACCCGAGC3'5'GCACAGTTGTCA TAAGACCCTCAAC3'5'GAGAAGGAATACACACCCGAGC3'5'GACCCTCAACAATGCCAAACC3'精品文档精品文档5'CAACGAGAAGGAATACACACC3'5'ACCCTCAACAA TGCCAAAC3'精品文档精品文档TKGAPDH 内参 qRT-PCR引物的设计如下：1.119bpATGATGTTGACCTT

8、GTCGCGTAACGATCCGTTTATCACCACTGACTACATGACATATATGTTCAAGTAT GACACTGTTCATGGACAATGGAAGCATCATGAGCTTAAGGTCAAGGATGAGAAGACTCTTCTCTTCGGT GAGAAGCCAGTCACTGTTTTTGGCATCAGAAACCCTGAAGATATCCCATGGGGTGAGGCTGGGGCTGAC TTTGTGGTCGAGTCCACTGGAGTCTTCACAGACAAAGACAAAGCTGCTGCCCATTTGAAGGGTGGTGCA AAGAAAGTCATCATCTCTGCTCCTAGCAAAGATG

9、CTCCCATGTTTGTTATGGGT GTCAACGAGAAGGAA TACACACCCGAGCTTAACATTGTTTCAAATGCCAGCTGTACAACCAACTGCCTTGCTCCCTTGGCCAAG GTCATAAACGACAGGTTTGGCATTGTTGAGGGTCTTATGACAACTGTGCACGCTATGGCTGCCACTCAA AAGACTGTTGATGGTCCATCAATGAAGGACTGGAGAGGTGGAAGTKGAPDH-qF 5' GTCAACGAGAAGGAATACACACC 3' TKGAPDH-qR 5' AGACCCTCAACA

10、ATGCCAAAC 3'精品文档精品文档2. 156bpATGATGTTGACCTTGTCGCGTAACGATCCGTTTATCACCACTGACTACATGACATATATGTTCAAGTAT GACACTGTTCATGGACAATGGAAGCATCATGAGCTTAAGGTCAAGGATGAGAAGACTCTTCTCTTCGGT GAGAAGCCAGTCACTGTTTTTGGCATCAGAAACCCTGAAGATATCCCATGGGGTGAGGCTGGGGCTGAC TTTGTGGTCGAGTCCACTGGAGTCTTCACAGACAAAGACAAAGCTGCTGCCCATTTGAAGGGTGGTGCA AAGAAAGTCATCATCTCTGCTCCTAGCAAAGATGCTCCCATGTTTGTTATGGGTGTCAAC GAGAAGGAATACACACCCGAGCTTAACATTGTTTCAAATGCCAGCTGTACAACCAACTGCCTTGCTCCCTTGGCCAAG GTCATAAACGACAGGTTTGGCATTGTTGAGGGTCTTATGACAACTG