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文档简介

1、IMP-4基因的克隆、原核表达及活性测定    【摘要】  目的:采用RT-PCR法获取TIMP-4基因,并通过原核表达获取具有生物活性的TIMP-4融合蛋白。方法:从SD大鼠心肌组织中提取总RNA,利用RT-PCR法扩增出TIMP-4基因,经基因序列分析后构建表达载体PET-28a(+)-TIMP-4,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导TIMP-4的表达。利用N2+-NTA纯化和复性后,根据其骨肉瘤细胞迁移能力的影响检测其活性。结果:克隆到编码序列完全正确的大鼠TIMP-4基因,能在大肠杆菌中获得高效表达,表达产物占全菌总蛋白的23.5%,N

2、2+-NTA纯化和复性后,纯度达90%以上。纯化后的融合蛋白使骨肉瘤细胞株的迁移能力得到显著抑制。结论:通过基因克隆和原核表达的方式可以大量获得具有生物活性的TIMP-4融合蛋白。 【关键词】  TIMP-4基因 克隆 基因表达 免疫活性    Abstract:  Objective:To extract the gene of TIMP-4 with RT-PCR methods and obtain the bioactive rat TIMP-4 fusion protein expressed in E. Coli. Methods:

3、 Total RNA was extracted from cardiac muscle of SD rat. TIMP-4 gene was obtained and amplified with RT-PCR method. The isolated fragment was sequenced, recombined with plasmid pET-28a(+) at EcoRI and Hind sites and transformed into E.coli cells. The expression of TIMP-4 was induced by IPTG. TIMP-4 p

4、rotein was purified and renaturalized by N2+-NTA. The capability of inhibiting migration of osteosarcoma cell line was used as a measure to assay its viability. Results: The TIMP-4 gene of the rat, which was cloned and correctly coded, could be highly expressed in the E.coli strain. The expressed pr

5、oduct of the TIMP-4 amounted for 23.5% of the total bacterial protein. The TIMP-4 amounted for at least 90% after N2+-NTA purification. The purified TIMP-4 protein could significantly inhibit the migration of osteosarcoma cell line. Conclusion: TIMP-4 fusion protein with bioactivity can be obtained

6、profusely by gene cloning and expression in E. Coli.    Key words:  TIMP-4; gene clone; expression; viability assay    目前对恶性肿瘤的治疗尚缺乏非常有效的措施,其主要原因在于肿瘤具有侵袭、转移和基因变异等特性,对肿瘤侵袭转移机制方面的研究成为肿瘤治疗的关键。组织基质结构的破坏和肿瘤新生血管的形成是肿瘤生长、转移得以实现的先决条件。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)为

7、一类蛋白水解酶家族,它能降解多种胶原蛋白、纤维连接蛋白和弹性蛋白等血管基膜和基质结构,为肿瘤的生长、转移创造合适的环境。金属蛋白酶组织抑制剂(tissue inhibitor of matrix metalloproteinase,TIMP)的发现是肿瘤研究上的一大突破,它是MMP的天然抑制剂,目前根据发现的时间顺序分别称为TIMP(14)。国内外对于TIMP-4的功能已经有了一些研究,但结果有所差异。Jiang等1的研究发现,TIMP-4可以抑制乳腺癌细胞的凋亡,而更多的实验表明TIMP-4为肿瘤生长的抑制因素2,3。为进一步开展对TIMP-4在骨肉瘤和软骨肉瘤方面的作用及其机制的研究,以及

8、对其在其他领域的功能,本实验采用分子生物学的基因克隆、表达和纯化等手段,力求获取具有生物活性的TIMP-4融合蛋白,为以后的研究打下基础。    1  资料和方法    1.1  材料     1.1.1  组织来源:成熟SD大鼠由第二军医大学实验动物中心提供。    1.1.2  菌种、质粒和细胞:大肠杆菌TG1、BL21(DE3)、pBluescriptSK(+)质粒、表达质粒pET-28a(+)均由第二军医大学神经生物学教研室提供

9、。骨肉瘤细胞株购自中国科学院上海细胞生化研究所。    1.1.3  试剂:RNA抽提试剂盒为上海化舜生物工程有限公司产品。RT-PCR试剂盒为Qiagen公司产品。Pyrobest DNA聚合酶为Takara公司产品。限制性核酸内切酶、T4 DNA连接酶为MBI公司产品。质粒抽提和胶回收试剂盒为Viogene公司产品。异丙基-D-硫代半乳糖苷酶(IPTG)为上海生工公司产品。Ni2+-NTA柱为Sigma公司产品。    1.2  方法    1.2.1  RT-PCR&#

10、160;   1.2.1.1  总RNA的提取:取成熟SD大鼠心肌组织约150 mg,参考萨姆布鲁克等4方法及RNA抽提试剂盒手册,电动匀浆后行总RNA的提取。    1.2.1.2  cDNA的合成:参考RT-PCR试剂盒实验手册进行。RNA(1g/l)2.0l,dNTPs(5mM dNTP)2.0l,Oligo-dT引物(10 unit/l)1.0l,RNase抑制剂(10 unit)1.0l,逆转录酶(4 unit)1.0l,无RNase水加至20l。37 温育60 min,然后90 温育5 min使逆转录酶失活。-2

11、0 保存。    1.2.1.3  PCR扩增:参考GeneBank(gi:48255910)发表的序列及表达载体pET-28a(+)多克隆位点、应用DNAstar软件设计引物,由上海生工公司合成。    上游引物: 5' TGCGAATTCATGCCTGGGAGCCCT 3'    EcoRI    下游引物: 5' GCAAACGTTGATCATCCCTGGTCACTG 3'    HindIII&#

12、160;   取逆转录产物2.0l为模板,按常规PCR反应条件,先将样品于94 变性5 min,加入2.5 u的Pyrobest DNA聚合酶,按下列参数循环35次:94 变性1 min,58 退火1 min,72 延伸40 s,最后一个循环后,72 延伸10 min,4 保存。    1.2.3  载体的构建及DNA序列分析:将RT-PCR产物平端与用EcoR酶切过的pBSK(+)质粒,回收后转化大肠杆菌TG1,挑白斑培养抽提质粒并进行初步酶切鉴定,选择3株酶切合格质粒送生工公司测序。把测序正确的质粒用EcoRI和Hind双酶切,胶

13、回收后与预先经EcoRI和Hind双酶切的表达载体pET-28a(+)在连接酶作用下相连接,构建T7启动子控制下的TIMP-4表达质粒(见图1)。将pET-28a(+)-TIMP-4表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)。    1.2.4  重组克隆的诱导表达、纯化和复性及鉴别:将pET-28a(+)-TIMP-4表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),接种单菌落至3 ml LB培养液中37 培养过夜,按2%的比例转接于LB培养液中(含50g/ml的卡那霉素),37 培养至A600条件下为0.61.0,加入IPTG(终浓度为1 mM/L),诱导35 h,离心收集菌体,进行SDS-PAGE蛋白电泳,薄层扫描检测TIMP-4的表达情况。诱导表达菌经超声破碎后,收

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