CTL前体频率对CD8+ CTL应答类型的影响

1、CTL前体频率对CD8+ CTL应答类型的影响    In a great river great fish are found; but take heed lest you be drowned.  The farmers are the founders of civilization and prosperity.  【摘要】  目的: 探讨CTL前体的频率对CTL应答类型的影响。方法: 用重组鼠IL4和GMCSF诱导小鼠骨髓来源DC发育成熟, 卵清蛋白（OVA）多肽激活DC,

2、 流式细胞术（FCM）分析DCOVA表型; 用OVA特异CD8+ T细胞和DCOVA接种Iab-/- C57BL/6小鼠, FCM检测小鼠体内OVA特异性CTL及特异性CTL对OVA特异性脾细胞的体内细胞毒作用, 并观察DCOVA免疫后小鼠肺肿瘤的生长情况。结果: 经OVA多肽刺激后, DC表面有高水平CD11c、 CD80、 CD54、 Iab、 Kb分子及pMHC复合体表达; 注射不同剂量（0×106、 0.25×106、 

3、;0.5×106、 1×106、 5×106）OVA特异性CD8+ T细胞后, 小鼠外周血OVA特异CTL占CD8+ T细胞的百分比分别为0.01%、 1.31%±0.21%、 2.34%±0.17%、 3.11%±0.25%、 4.23%±0.32%, 注射CD8+ T细胞组OVA特异CTL百分比均较对照组明显增高（P<0.05）, 未接种CD8+ T细胞的野生型C57BL/6小鼠外周血O

4、VA特异CTL为2.45%±0.22%; 各剂量组CFSElow细胞数不变, CFSEhigh细胞随着CD8+ T细胞数的增加而逐渐减少, 小鼠肺肿瘤数随接种CD8+ T细胞数的增加而减少（P0.05）。结论: 增加CTL前体频率可使CTL应答类型由CD4+ T细胞依赖型转变为CD4+ T细胞非依赖型()。 【关键词】  CTL前体 频率 CTL应答 CD4+ T细胞CD8+ T细胞通过细胞膜表面的T细胞（TCR）识别特异性抗

5、原而活化、 增殖、 分化为细胞毒性T细胞（CTL）, 对靶细胞发挥特异性杀伤作用。正常情况下, 细胞毒性T细胞的活化依赖于CD4+ T细胞的辅助。CD4+辅助性T细胞（Th）接受抗原提呈细胞（APC）提呈的抗原活化以后可分泌细胞因子和表达共刺激分子, 辅助CD8+ T细胞的活化。然而有研究报道, 许多病毒在缺乏Th细胞的条件下仍可刺激机体产生特异性的CTL免疫1,  2。表明CD8+ T细胞可通过某种信号方式活化其自身, 而这种信号的加强要求足够数量的CD8+ T细

6、胞。我们通过给CD4+ Th细胞缺陷小鼠注射卵清蛋白（ovalbumin, OVA）特异的CD8+ T细胞, 探讨CTL前体频率对CTL免疫应答的Th细胞依赖性的影响。1  材料和方法Nature is the glass reflecting truth.  1.1  材料  OVA多肽为SIINFEKL公司产品(医药学/临床医学论文 )。FITC标记的抗鼠CD11c、 CD40、 CD80、 CD54、 Iab、 Kb和H2

7、0;Kb/OVA复合物（pMHC）抗体为Pharmingen公司产品。PE标记的抗鼠H2 Kb/ OVA257264抗体购自Beckman Coulter公司。重组鼠IL4和GMCSF为RD公司产品。荧光染料CFSE为Molecular Probes公司产品。MO4为转OVA基因的黑色素瘤细胞, 具有高度肺转移特性, 由本室保存。OVA特异的TCR转基因OT小鼠和野生型C57BL/6小鼠（B6; CD45.2+）、 Iab缺陷型（Iab-/-）C57BL/6小鼠（雌性, 体质量2330 g,&#

8、160;68周龄）由Jackson实验室引进。Love makes obedience easy.  1.2  方法1.2.1  小鼠骨髓来源DC的培养及激活  CO2窒息法处死小鼠, 无菌条件下取小鼠股骨、 胫骨,  PBS冲洗骨髓至髓腔变白, 收集冲洗液,  1 500 g离心5 min,  收集细胞用PBS洗2次。TrisNH4Cl裂解红细胞,  用含20 g/L

9、0;GMCSF、 1  g/L IL4的DMEM培养基重悬细胞至2×109/L, 按每孔4 mL加入24孔板,  置37、 50 mL/L CO2培养。第3天更换培养液,轻轻晃动培养板, 弃去上清, 补入含细胞因子的DMEM完全培养液。第6天细胞换液,  用吸管轻轻冲洗,  收集上清,  1 500 g离心5 min,  用含20 g/L

10、  GMCSF、 1   g/L  IL4 和15  g/L TNF的DMEM培养液重悬细胞, 继续培养24 h后收集细胞, 换无血清的AIMV培养液, 加入OVA多肽（0.3 g/L）,  置37、 50 mL/L  CO2培养过夜, 次日收集细胞进行表型鉴定。1.2.2  OVA特异性CD8+ T细胞的分离 

11、60;CO2窒息法处死OT小鼠, 无菌分离脾脏, 置于盛有适量无菌PBS的小平皿中, 经200目钢网研磨, 制成单个细胞悬液。PBS洗2次。用 RPMI1640培养液重悬细胞, 加入尼龙毛柱中, 常规培养1 h, 收集流出的T淋巴细胞, PBS洗2次, 然后将细胞悬浮于PBS中, 采用免疫磁珠结合的抗CD4单克隆抗体（mAb）阴性选择法（按说明书进行操作）去除CD4+ T细胞,  富集CD8+ T细胞。1.2.3  

12、DC表型分析  收集经OVA刺激的骨髓细胞, 用PBS悬浮为1×109/L, 加入流式细胞术（FCM）测定管, 每管1 mL, PBS洗2次, 离心去上清后加入PBS 100  L, 分别加入FITC标记的抗鼠CD11c、 CD40、 CD80、 CD54、 Iab、 Kb和pMHC抗体1  L。混匀后于4避光孵育30 min,  PBS 洗2 次

13、,  FCM分析。1.2.4  CD8+ T细胞接种小鼠  OVA特异CD8+ T细胞以不同剂量（0×106、 0.25×106、 0.5×106、 1×106、 5×106）经尾静脉接种Iab-/-C57BL/6小鼠, 每个剂量组10只, 野生型C57BL/6小鼠作为对照未接种CD8+ T细胞, 第2天野生型及Iab-/-C57BL/6小鼠均尾静脉接种DCOVA（0.5×10

14、6/只）, 第7天采血检测OVA特异性CTL, 次日尾静脉注射MO4细胞（1×106/只）, 每个剂量组注射5只小鼠（另外5只用于体内细胞毒实验）, 21 d后杀死小鼠肉眼观察小鼠肺肿瘤生长情况, 计数肿瘤数目。None but a wise man can employ leisure well.  1.2.5  小鼠体内OVA特异CTL的检测  小鼠断尾取血50 L, 加入10  L PE标记的H2 Kb/OVA

15、257264试剂, 混匀, 室温避光孵育30 min,  加入1 L FITC标记的抗CD8 mAb, 室温避光孵育30 min, 再加入红细胞裂解液, 室温避光作用30 min后用含5 g/L BSA的PBS洗2次, FCM分析。  1.2.6  体内细胞毒实验  CO2窒息法处死C57BL/6小鼠, 无菌取脾脏, 制备脾细胞悬液, 用无血清RPMI164

16、0培养液调整细胞密度为5×109/L, 加入15 mL离心管, 每管10 mL, 分别加入CFSE使其终浓度为0.6  mol/L和3.0 mol/L, 制备CFSElow细胞（0.6  mol/L）和CFSEhigh细胞（3.0  mol/L）, CFSEhigh细胞加入OVAI多肽, 置37、 50 mL/L CO2孵育1 h。1 500  g离心5 m

17、in,  PBS洗2次,  再将CFSElow细胞和CFSEhigh细胞按1519比例混合, 注射上述经OVA特异CD8+ T细胞和DCOVA免疫的小鼠（1×106/只）, 每个剂量组5只, 16 h 后制备脾细胞悬液FCM分析。1.2.7  统计学处理  实验数据用x±s表示, 应用SPSS11.5统计分析软件进行方差分析。P0.05为有统计学意义。Nightingales will not sing in a cage.&

18、#160; 2  结果2.1  活化DC表面膜分子的表达  小鼠骨髓细胞培养78 d后, 镜下可见细胞具有典型的DC形态,  经细胞计数和FCM鉴定其纯度达85%以上, 细胞表面CD11c表达率为90.5%, CD80表达率为79.8%, CD54表达率为81.2%,  Iab表达率为71.3%,  Kb表达率为83.1%, pMHC复合体表达率为69.6%（图1）。表明细胞为活化DC（即DCOVA）。The pea

19、cock has fair feathers, but foul.  图1  OVA多肽激活的DC表面分子的分析（略）2.2  小鼠体内OVA特异性CTL的检测  不同浓度CD8+ T细胞接种Iab-/-小鼠, 第2天接种DCOVA, DCOVA免疫后第6天采血检测OVA特异CTL, FCM分析结果显示, 注射不同浓度CD8+ T细胞后, 小鼠外周血OVA特异CTL（即H2 Kb/OVA257264、 CD8双阳性细胞）占CD8+

20、60;T细胞的百分比分别为0.01%、 1.31%±0.21%、 2.34%±0.17%、 3.11%±0.25%、 4.23%±0.32%, 注射CD8+ T细胞组OVA特异CTL百分比均较对照组明显增高（P<0.05）。未接种CD8+ T细胞的野生型C57BL/6小鼠外周血OVA特异CTL百分比为2.45%±0.22%（图2）。图2  CTL前体频率对OVA特异性CTL的影响（略）2.3  体内细胞毒实验  

21、;OVA特异CD8+ T细胞和DCOVA免疫后第6 天小鼠尾静脉注射CFSElow和CFSEhigh混合细胞, 16 h后制备脾细胞悬液, 经FCM分析, 结果显示, 各剂量组CFSElow细胞不变, 相对数均为100, 未接种CD8+ T细胞的Iab-/-小鼠CFSEhigh细胞相对数为99,  随着注射CD8+ T细胞数的增加, CFSEhigh细胞逐渐减少, 表明小鼠体内产生了OVA特异性免疫, 对照组C57BL/6小鼠的CFSE

22、high细胞为43（图3）。 论文教育信息网  图3  OVA特异性CTL的体内细胞毒作用（略）2.4  特异性CTL对小鼠肺肿瘤生长的影响  MO4细胞尾静脉注射OVA特异CD8+ T细胞和DCOVA免疫的小鼠, 21 d后杀死小鼠, 于小鼠肺脏表面可见大小不等的褐色肿瘤生长, 随着注射的CD8+ T细胞数的增加, 肿瘤数减少（P0.05）, 注射1×106、 5×106 CD8+ &

23、#160;T细胞组未见肿瘤生长（图4、  5）。None but a wise man can employ leisure well.  图4  注射CD8+ T细胞对Iab-/-小鼠肺肿瘤生长的影响（略）A:  未接种CD8+ T细胞; B: 注射1×106 CD8+ T细胞.3  讨论    CD8+ T细胞在抗肿瘤及抗细胞内感染免疫中发挥重要的作用。通常情况下, 

24、60;CD8+ T细胞的活化需要Th细胞的辅助3, 4。然而许多病毒可刺激CTL免疫而不需Th细胞的辅助, 表明CD8+ T细胞可通过某种信号方式活化其自身, 而这种信号的加强要求足够数量的CD8+ T细胞。为了探讨CD8+ T细胞频率对CTL应答类型的影响, 我们从OT小鼠分离OVA特异的CD8+ T细胞, 以不同剂量注射Iab-/-小鼠, 同时注射相同剂量DCOVA,  5 d后检测小鼠体内OVA特异性CTL。OT小鼠为OVA特异性TCR V

25、2V5转基因的C57BL/6小鼠5, 将其脾细胞过尼龙毛柱去除B淋巴细胞, 再采用免疫磁珠结合的抗CD4  mAb阴性选择法去除CD4+ T细胞, 可获得纯度大于98%的OVA特异的CD8+/V2V5 T淋巴细胞。Iab-/-小鼠由于其MHC类分子Iab缺陷导致体内缺乏能辅助OVA特异性CD8+ T细胞活化的CD4+ T细胞6。The emperor treats talent as tools, using their strongpoint to his advantage.  图5

26、0; OVA特异性CTL对Iab-/-小鼠肺肿瘤生长的影响（略）本研究结果显示, 未注射T细胞的Iab-/-小鼠外周血OVA特异CTL占CD8+ T细胞的百分比为0.01%, 注射不同浓度 OVA特异CD8+ T细胞后, OVA特异CTL占CD8+ T细胞的百分比分别为1.31%、 2.34%、 3.11%、 4.23%; 未接种CD8+ T细胞的野生型C57BL/6小鼠OVA特异CTL百分比为2.45%。提示在Th细胞缺陷的Iab-/-小鼠由于体内OVA特异CTL

27、前体频率极低, 虽有DC的抗原提呈作用亦不能刺激产生特异CTL应答。相反, 未接种CD8+ T细胞的野生型C57BL/6小鼠由于体内有OVA特异Th细胞存在, 给予DCOVA刺激后可诱导产生特异CTL免疫。给Iab-/-小鼠注射OVA特异CD8+ T细胞后, 在缺乏特异性Th细胞的条件下有效诱导了特异性CTL应答。表明增加CTL前体频率可使CTL应答类型由Th细胞依赖型转变为Th细胞非依赖型。为了验证这些CTL的细胞毒活性, 我们给小鼠注射CSFE标记7的CFSElow脾细胞和OVA特异CFSEhigh脾细胞, 通

28、过FCM分析特异性CTL免疫对OVA致敏的CFSEhigh细胞的杀伤作用。结果显示, 随着注射的CD8+ T细胞数目的增加, 小鼠体内CFSEhigh细胞逐渐减少。进一步通过肿瘤攻击动物实验证实, 随着注射的CD8+ T细胞数的增加, 小鼠肺肿瘤生成减少, 表明小鼠体内产生了OVA特异性CTL免疫。本实验证实了增加CTL前体频率可使CTL应答类型由Th细胞依赖型转变为Th细胞非依赖型, CD8+ T细胞通过什么方式活化其自身有待进一步研究。    【参考文献】

29、60; 1 Rahemtulla A, FungLeung WP, Schilham MW, et al. Normal development and function of CD8+ cells but markedly decreased helper cell activity in mice lacking CD4J. 

30、;Nature, 1991, 353(6340): 180-184.2 Liu Y, Mullbacher A. The generation and activation of memory class I MHC restricted cytotoxic T cell responses to influenza A virus in

31、 vivo do not require CD4+ T cellsJ. Immunol Cell Biol, 1989, 67(6): 413-420.3 Bachmann MF, Wong BR, Josien R, et al. TRANCE, a tumor necrosis factor family memb

32、er critical for CD40 ligandindependent T helper cell activationJ. J Exp Med, 1999, 189(7): 1025-1031.4 Lu ZL, Yuan X, Zhou E, et al. CD40independent pathways of T cell help for priming of CD8+ cytotoxic T ly