STP-VD-9401-01 头孢克肟分散片微生物限度验证方

1、头孢克肟分散片微生物限度检查法验证方案文件编号：批准日期： ： 验证方案名称验证编号头孢克肟分散片微生物限度检查法验证方案STP-VD-9401-01起草人部门起草日期  审核人部门审核日期  批准人部门批准日期验证小组成员名单组 长姓名职务/职称部门何锋经理质量部成 员姓名职务/职称部门陈娆QC主管质量部康清勇QA主管质量部钟元芳QC质量部头孢克肟分散片微生物限度检查验证方案目录1概述2目的3范围4验证程序5再验证6结果评价及最终结论1概述本品为头孢类口服固体制剂，细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证选用薄膜过滤法。控制菌检查方法的验证选用薄膜过滤法，主要

2、为大肠埃希菌检查法的验证。阳性菌对照选用相应的大肠埃希菌，阴性菌对照选用金黄色葡萄球菌。2目的确认所采用的方法适合于头孢克肟分散片的微生物限度检查。即确认该供试品在该检验量和检验条件下，确保检验结果的准确、可靠及检验方法的完整性。3范围适用于本公司生产的头孢克肟分散片（规格：0.1g）的微生物限度检查。4验证程序4.1 培养基营养琼脂养培养基 玫瑰红钠琼脂培养基 胆盐乳糖培养基胆盐乳糖发酵培养基 营养肉汤培养基 改良马丁培养基 改良马丁琼脂培养基 曙红亚甲蓝琼脂培养基 MUG培养基4.2 验证试验用菌种大肠埃希菌（Escherichia coli）CMCC（B）44 102金黄色葡萄球菌（St

3、aphylococcus aureus）CMCC（B）26 003枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）CMCC（B）63 501白色念珠菌（Candida albicans）CMCC（F）98 001黑曲霉（Aspergillus niger）CMCC（F）98 003以上菌种均由中国药品生物制品检定所提供，并且不超过5代。4.3 方法：按中国药典2005年版二部微生物限度检查进行验证实验。4.3.1菌液制备：4.3.1.1 取经3035培养1824小时的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的营养肉汤培养物1ml加0.9%氯化钠溶液9ml，10倍系列稀释至10-510-7，细

4、菌数约为50100cfu/ml，做活菌计数备用。4.3.1.2 取经2328培养2448小时的白色念珠菌霉菌液体培养物1ml加0.9%氯化钠溶液9ml，10倍系列稀释至10-510-7，细菌数约为50100cfu/ml，做活菌计数备用。4.3.1.3 取经2328培养1周的黑曲霉斜面培养物，加入35ml0.9%氯化钠溶液洗下霉菌孢子，吸取出菌液，然后取1ml加0.9%氯化钠溶液9ml，10倍系列稀释为10-410-5，细菌数约为50100cfu/ml，做活菌计数备用（见附表一）。4.3.2 供试品溶液的制备：取供试品10g，加入pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，溶解，制成1：10

5、的溶液，作为供试液。4.3.3 细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证：4.3.3.1 薄膜过滤法：取规定量供试液，过滤，冲洗，再最后一次冲洗液中加入试验菌50100个/ml，过滤。取出滤膜，置培养基中培养，规定温度培养2472小时，观察计数。4.3.3.2 试验组:取供试液1ml，过滤，冲洗，在最后一次冲洗液中加入50100个试验菌，作2个皿/菌株，取出滤膜，置培养基中培养2472小时观察计数。4.3.3.3 活菌组：测定每一菌株的试验菌数，1ml/皿，作2个皿/菌株。供试品对照组 ： 测定供试品本底菌落数，取供试液1ml，过滤，冲洗，取出滤膜，置培养基中培养2472小时，观察计数，作2个皿/菌株。

6、试验结果(见附表二。结果判断4.3.3.6.1验证试验至少应进行3次独立的平行试验，并分别计算各试验菌每次试验的回收率。回收率(%=×100%4.3.3.6.2细菌计数方法与霉菌和酵母菌计数方法可以不一致。4.3.3.6.3以上各试验菌的回收率均能达到70%以上的检测方法为准。4.3.3.6.4若试验组的菌种回收率（试验组的平均菌落数减去供试品对照组的平均菌落数的值占菌液组的平均菌落数的百分率）均不低于70%，按该供试液制备方法和计数法测定供试品的细菌、霉菌及酵母菌数。4.3.3.6.5若任一次试验中试验组的菌回收率低于70%，应采用薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试

7、品的抑菌活性，并重新验证。4.3.4.1.1试验组：取供试液10ml，过滤，冲洗，在最后一次冲洗液中加入10100cfu大肠埃希菌，过滤，取出滤膜，置100ml胆盐乳糖培养基中,3537培养1824小时。取上述培养物0.2ml接种至含5mlMUG培养基的试管内,培养,于5小时、24小时在366nm紫外线下观察，同时用未接种MUG培养基作本底对照。若管内培养物呈现荧光，为MUG阳性，不呈现荧光，为MUG阴性。观察后，沿培养管的管壁加入数滴靛基质试液，液面呈玫瑰红色，为靛基质阳性；呈试剂本色，为靛基质阴性。本底对照应为MUG阴性和靛基质阴性。如MUG阳性、靛基质阳性，判供试品检出大肠埃希菌；如MU

8、G阴性，靛基质阴 性，判供试品未检出大肠埃希菌；如MUG阳性，靛基质阴性，或MUG阴性，靛基质阳性，则应取胆盐乳糖培养基的培养物划线接种于曙红亚甲蓝琼脂培养基或麦康凯琼脂培养基的平板上，培养1824小时，观察确认是否为大肠埃希菌。若平板上无菌落生长、或生长的菌落与表1所列的菌落形态特征不符，判供试品未检出大肠埃希菌。若平板上生长的菌落与表1所列的菌落形态特征相符或凝似，应进行分离、纯化、染色镜检和适宜的生化试验，确认是否为大肠埃希菌。表1 大肠埃希菌菌落形态特征培养基菌落形态曙红亚甲蓝琼脂呈紫黑色、浅紫色、蓝紫色或粉红色，菌落中心呈深紫色或无明显暗色中心，圆形，稍凸起，边缘整齐，表面光滑，湿润

9、，常有金属光泽。麦康凯琼脂鲜桃红色或微红色，菌落中心呈深桃红色，圆形，扁平，边缘整齐，表面光滑，湿润阴性菌对照组：阴性菌对照加入金黄色葡萄球菌10100cfu，方法同试验组。试验结果(见附表三。结果判断（1）阴性菌对照组不得检出阴性对照菌。（2）若试验组检出试验菌，按此供试液制备方法和控制菌检查法进行供试品的该控制菌检查。（3）若试验组未检出试验菌，应采用增加冲洗量、加入中和剂或灭活剂等方法消除供试品的抑菌活性，并重新验证。5再验证如药品的处方、生产工艺、原辅料制造商、主要制造设备的变更或原检验条件发生改变可能影响检验结果时应重新进行验证。6结果的评价及最终结论评价: 验证结论批准：Q A：

10、日期： ：质 量 部： 日期： ：验证组组长： 日期： ： 验证委员会主任： 日 期： ： 验证委员会（签章）年 月 日附表一菌落计数（cfu/ml）品名： 批号： 规格：营养琼脂培养基 批号： 玫瑰红钠琼脂培养基 批号：菌种菌落数(cfu/ml大肠埃希菌(10 金黄色葡萄球菌(10 枯草芽孢杆菌(10 白色念珠菌(10 黑曲霉菌(10 计数12平均值检验人： 日期： 复核人： 日期：附表二 细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证记录品名： 批号： 规格：营养琼脂培养基 批号： 玫瑰红钠琼脂培养基 批号：菌株大肠埃希菌金黄色葡萄球菌枯草芽孢杆菌白色念珠菌黑曲霉菌菌种代数试验组菌落数平均菌落数菌液组菌落数平均菌落数供试品对照组菌落数平均菌落数试验组菌回收率(%结论：检验人： 日期： 复核人： 日期：附表三 大肠埃希菌检查法验证记录品名： 批号： 规格：胆盐乳糖培养基 批号： MUG培养基 批号：试验菌菌种代数阴性对照菌菌种代数胆盐乳糖（18-48hr）试验组：+/