浆样树突状细胞重建与单倍体相合造血干细胞移植的慢性移植物抗宿主病和复发关系研究

1、浆样树突状细胞重建与单倍体相合造血干细胞移植的慢性移植物抗宿主病和复发关系研究         08-03-04 16:44:00     作者：吴继颖 黄晓军    编辑：studa20【摘要】  为了探讨浆样树突状细胞(PDC)在单倍体相合造血干细胞移植术后重建的特点及其与慢性移植物抗宿主病（cGVHD）和患者复发的关系，采用流式细胞术对19例白血病患者移植后外周血树突状细胞（DC）亚群晚期重建进行动态监测，并将其与患者c

2、GVHD 和复发的关系进行分析。结果显示： 白血病患者髓样树突状细胞（MDC）、MDC1和DC百分比和绝对细胞数以及MDC/PDC比率均低于正常对照(P<0.05)，而髓样树突状细胞2（MDC2）、PDC百分数与对照组相比无统计学差异。患者移植后PDC比例于12月时达到正常（P=0.494），而PDC绝对值和其余各亚群比例及数量均于移植后9月时恢复到正常水平，与对照组相比无统计学差异（P>0.05）；MDC/PDC于移植后120天时已达到正常对照组水平（P=0.602）。发生cGVHD 患者移植后120天PDC比例高于未发生组 ；患者复发后MDC1比例及数值下降，而MDC2和PDC

3、比例及数值略回升。结论：白血病患者单倍体相合造血干细胞移植前外周血DC比例、绝对数及MDC/PDC比率均减少；移植后MDC/PDC比率恢复较快 ；各亚群比例和数量在移植后9月后基本恢复正常；且恢复情况与慢性移植物抗宿主病发生和患者复发相关。 【关键词】  单倍体相合造血干细胞移植； 浆样树突状细胞； 慢性移植物抗宿主病； 白血病复发 Investigation of Plasmacytoid Dendritic Cell Reconstitution and Its Relationship with cGVHD and Relapse after Haploidentical He

4、matopoietic Stem Cell Transplantation       Abstract    To investigate the characteristics and significance of reconstitution of peripheral blood plasmacytoid dendritic cell (PDC) precursors after allogeneic human leukocyte antigen mismatched/ haploidenti

5、cal hematopoietic stem cell transplantation, and its relationship with chronic graft versus host disease（cGVHD）and relapse，   19 patients with  leukemia  were enrolled for this study. Peripheral blood dendritic cell (DC) subsets of patients and healthy controls were detected by f

6、low cytometry, and the correlations between reconstitution of DC and cGVHD, relapse were analyzed. The results showed that compared with healthy subjects, patients with leukemia had a significantly decreased proportion and absolute number of myeloid dendritic cell (MDC) , MDC1 , DC and the ratio of

7、MDC/PDC (P<0.05). There were not statistically different in MDC2 and PDC between patients and healthy subjects. After transplant, all the proportion of WBC and absolute numbers of DC reached to healthy controls levels at 9 months (P>0.05), besides the proportion of PDC which reached to healthy

8、 controls levels at 1 year（P =0.494）. Compared with levels before relapse, the proportions of MDC1, MDC, DC and the ratio of MDC/PDC were lower, but proportions of MDC2 and PDC were slightly higher after relapse. Patients with a 'high' PDC recovery profile had an improved cumulative incidenc

9、e of cGVHD in contrast to patients with a 'low' PDC recovery profile on day 120  after transplantation (P=0.007).  It is concluded that compared with healthy subjects,  de novo leukemia patients have a significantly decreased proportion and absolute number of DC  and the

10、ratio of MDC/PDC before haploidentical hematopoietic stem cell transplantation; while ratio of MDC/PDC can be normalized with relative rapidity, the proportions of all DC subsets reached to normal levels on the whole at 9 months after transplantation, and also recovery level of DCs is correlated wit

11、h occurrence of cGVHD and relapse.    Key words    haploidentical hematopoietic stem cell transplantation;  plasmacytoid dendritic cell;  chronic graft versus host disease;  leukemia relapse     目前同种异基因造血干细胞移植（allogeneic hematopoietic

12、stem cell transplantation， AlloHSCT）供者主要为HLA完全相合的同胞或非亲缘供者（HLAmatched sibling donor, MSD or HLAmatched unrelated  donor, MUD），在一些应用HLA不完全相合供者的移植中，供者的T淋巴细胞绝大部分已在体外去除1-4。我们的研究已证实，GIAC体系(即G：粒细胞集落刺激因子， I： 强免疫抑制剂， A：抗胸腺球蛋白，  C: 外周血与骨髓联合)不需要进行体外T淋巴细胞去除，急慢性GVHD发生率、移植相关死亡率、复发率，以及两年无病生存率和总生存率均与同期配型完

13、全相合患者相似，从而使HLA不完全相合亲缘供者(HLAmismatched family donor, MFD)移植/单倍体相合造血干细胞移植（haploidentical hematopoietic stem cell transplantation）的方法得到改进，成功跨越HLA屏障，但我们这一体系成功的机制还未完全清楚5-8。树突状细胞（dendritic cells， DC）是专职的抗原呈递细胞(antigen presenting cells， APC),不仅能够显著刺激初始型T细胞(naive T cells)进行增殖, 充当机体免疫反应的始动者，而且可以通过调节T细胞的类型使机体

14、产生免疫激活或免疫耐受9；慢性GVHD的发生需要供受者APC共同参与10-13。此外，宿主APC是运输已致敏的供者T细胞和NK至靶组织所必需的。HLA完全相合造血干细胞移植后DC的重建可影响cGVHD和复发，HLA不合/单倍体相合造血干细胞移植后DC的晚期重建目前很少报道；未去T淋巴细胞模式下DC重建研究未见报告。对此我们进行研究，以了解DC重建与cGVHD、复发是否相关。    中国实验血液学杂志  J Exp Hematol 2007; 15(2)浆样树突状细胞重建与人类白细胞抗原不合/单倍体相合造血干细胞移植慢性移植物抗宿主病/复发关系初探材料和方

15、法    对象    患者  从2005年2月至2006年4月间，对在北京大学人民医院血液病研究所行HLA不完全相合单倍体移植的19位患者和12例健康亲缘供者进行研究。患者男性14例，女性5例，中位年龄21（12-51）岁。19例患者中急性髓性白血病5例，急性B淋巴细胞白血病6例，慢性髓性白血病7例，骨髓增生异常综合症/急性髓性白血病1例。 所有患者在进入研究前均签署知情同意书，供者标本在获取前均得到本人同意，本研究经医院伦理委员会审核通过。    供者  所有供者均为亲缘供者,移植前

16、进行HLA配型，HLAA、B位点检测方法为低分辨方法,类抗原采用高分辨方法。依据HLA配型相合程度、年龄、性别以及健康状况选择供者。其中3/6个位点不合10例，2/6个位点不合7例，1/6个位点不合2例。    预处理方案    阿糖胞苷(cytarabine, AraC)4 g/(m2·d)×2天,马利兰(busulfan, Bu) 4 mg/(kg·d)×3天,环磷酰胺(cyclophosphamide, Cy)1.8 g/（m2·d）×2天,甲基环己亚硝脲(simust

17、ine, MeCCNU) 250 mg/（m2·d）×1天,抗人胸腺球蛋白(antihuman thymus globulin, ATG) 2.5 mg/(kg·d)×4天。    供者动员及造血干细胞采集    所有患者均接受供者经GCSF动员后采集的骨髓和外周血干细胞联合移植。所有供者接受重组人粒细胞集落刺激因子(rhGCSF)5 g/(kg·d),连续皮下注射5-6天。第4天采集骨髓, 有核细胞要求达（3-4）×108/kg；第5-6天应用COBE血细胞分离机采集同一供

18、者外周血干细胞,循环总量10 L,总单个核细胞达（3-4）×108/kg。    移植物抗宿主病预防和治疗    应用环孢菌素A+霉酚酸酯+短程甲氨喋呤方案。环孢菌素A 2.5 mg/（kg·d）静脉滴注,移植前9天至肠道功能恢复正常后改为口服，一般用至移植后9-12月；霉酚酸酯0.5 g每12小时1次，口服，移植前10天至植活后减半，后渐停药；甲氨喋呤移植后1天15 mg/m2，移植后3、6、11天10 mg/m2。cGVHD根据受累器官和广泛程度分为局限型和广泛型。局限型cGVHD 包括局限的皮肤损害和(或)

19、本病所致的肝脏损害。广泛型cGVHD 有下述二者之一加上另外4 项中任意3 项:皮肤全身广泛受损; 病理证实局部皮肤病变并兼有cGVHD 的肝损害。另外4 项包括:肝脏病理呈慢性重症肝炎或肝硬化,眼部干燥(Schirmer 试验湿度仅5 mm) ,唾液腺或口腔粘膜有本病病理,任何其他的靶器官受损 。发生cGVHD后根据情况加用皮质激素、CsA、MMF、FK506、依木兰等治疗。    植活监测    所有患者均于移植后6天始接受rhGCSF 5 g/(kg·d),连续皮下注射至嗜中性粒细胞绝对计数(absolute 

20、; neutrophil count, ANC)2.0×109/L。连续3天 ANC0.5×109/L被认为白细胞植入；脱离血小板输注7天,血小板20×109/L被认为血小板植入。移植后行骨髓形态学、遗传学检查、HLA  DNA分型及DNA指纹图(北京市公安局物证所进行)检查证实供者植入情况,每例患者均采用2种或以上指标。    流式细胞术检测分析    单克隆抗体及其他试剂  抗CD14,CD19PerCP及阴性对照单克隆抗体，溶血素均购自美国Becton Dickinson公司；抗

21、BDCA1PE( Mouse IgG2a, clone: AD58E71)、抗BDCA2FITC (Mouse IgG1, clone: AC1441)、抗BDCA3APC(Mouse IgG1, clone: AD514H121 )单克隆抗体均购自德国美天旎公司。    细胞表面标记  每管取新鲜抽取的EDTA抗凝血至少100  l，分别加入各种抗体及阴性对照抗体10 l ,4避光孵育15分钟；加溶血素2 ml室温避光10分钟，溶解红细胞；然后300×g离心5分钟,弃上清,用PBS将标记细胞洗涤2次；加入含1%多聚甲醛PBS

22、0; 200 l, 固定后24小时内上流式细胞仪检测。    流式细胞仪检测  流式细胞仪为FACSort型（Becton Dickinson 公司产品，装备双激光管），应用Cellquest 软件进行数据分析。采用四色荧光标记活细胞膜，每份标本获取（1-2.5）×105个细胞，用FSC/SSC设门画出有核细胞群R1，以去除细胞碎片和死细胞；二维点图显示R1内细胞，设CD14、CD19 PerCP阴性细胞群为R2，显示R2群细胞,分析BDCA2 FITC阳性及BDCA1PE, BDCA3APC阳性细胞,即分别为PDC和MDC1、MDC2 ,并计

23、算DC、MDC1、MDC2以及PDC占有核细胞的百分比。    统计学处理    实验数据应用统计软件SPSS 10.0进行分析，连续变量采用非参数MannWhitney U检验，cGVHD的发生率评估应用KaplanMeier曲线，P<0.05被认为具有显著性差异。    结    果    病人特点    19位患者和12例健康亲缘供者纳入本研究，HLA配型3/6不合10例，2/6不合7例，1/6不合2例。发生cGVHD  11例，其中局限型7例，广泛型4例；复发2例，死亡5例，余无病生存。具体情况见表1。    外周血DC前体细胞晚期重建    正常对照组和患者移植前的DC及其亚群  12例来源于健康供者的外周血标本被作为对照组。白血病患者预处理前MDC1、MDC及DC在白细胞中所占百分比较正常对照组明显减低，分别为MDC1 0.03% vs 0.435%； MDC 0.045%