电喷雾LCMS法确认蜂蜜中的氯霉素和其他相关类似物

1、电喷雾LC/MS法确认蜂蜜中的氯霉素和其他相关类似物范围： 由于下列种种原因，分析蜂蜜中的氯霉素和其相关的化合物变得非常重要。在蜂蜜的生产过程中，氯霉素常用在蜂巢中以减少疾病的侵入。氯霉素(CAP)可以引起严重的急性反应（包括在敏感的个体中引起急性贫血）。因此氯霉素的残留引起了人们的关注。最近有报道发现在从亚洲进口的食物原料（包括蜂蜜）中发现了氯霉素。目前仅有很有限的报道使用电喷雾质谱分析蜂蜜或其他食物中的氯霉素和 。一些政府方法（欧盟，加拿大，洲政府）已有报道，但是仍然没有在公开的文献中报道。我们实验室已经分析该类化合物很长时间了。传统的分析和确认方法是将样品从组织或体液中使用液液萃取分离，

2、然后硅烷化衍生为挥发性的衍生物，最后使用GC/ECD或负化学电离源的GC/MS方法分析。最近我们使用电喷雾液质联用方法确认并分析了虾中的该类化合物。 该方法是采用负的电喷雾离子阱法LC/MSn来定性分析蜂蜜中的氯霉素和相关的化合物。由于色谱和质谱条件已经预先用来分析florfenicol 的代谢物florfenicol胺，因此在第一部分中的色谱条件方法已经可用来分析该种类的胺基代谢物。但是没有评估蜂蜜中的胺基代谢物是否存在。原理：1 提取 将10克蜂蜜溶于10毫升水，然后用20毫升乙酸乙脂提取，振摇和离心。重复此步骤并将乙酸乙脂层蒸干。然后加入30毫升水于容量瓶中，振摇，离心后加入两倍的己烷清

3、洗。水相通过一系列的固相微萃取柱。在最后的固相萃取柱中用甲醇提取分析物。甲醇蒸干。提取物用少量的0.1%的甲酸重新溶解滤过到液相进样瓶。2 质谱分析A. 定性分析 蜂蜜中的氯霉素定性分析是基于该类化合物唯一的质谱特征峰。该类化合物一个唯一的特征是他们都包含有两个氯原子，因此有特征的同位素峰。为了充分利用该特征，不仅仅从母离子(M-H)-获得二级质谱图MS2，而且还从对应的M+2(35Cl37Cl)同位素峰得到二级质谱图。例如，在氯霉素的二级质谱图(M-H-基团 m/z 321/323)，主要的离子m/z 194是对应的(M-H-(NH2COCCl2H)-。另外在谱图中也存在离子m/z 176

4、m/z 194-(H2O)- (15%)，249（30%），M-H-(2HCl)-和257M-H-(HCOCl)- (25%)。这些离子在m/z 323的二级质谱中也存在。尽管257的质谱峰分离为两个离子峰m/z 257 , 259（两个峰有同样的丰度），显示从35Cl37Cl的母离子峰掉了一个氯原子（35Cl或37Cl中的一个）。Florfenicol的二级质谱图的主要离子是母离子丢失了HF。当35Cl37Cl母离子(m/z356)被单独选择出来，离子被观察到或35Cl37Cl的离子断裂，m/z337.8的离子被观察到。为了获得进一步的确认，得到335.8的离子MS3。通常给出219的离子（

5、通常100%），和m/z119，184，264。对于ThiamphenicolM-H- 等于354/356，断裂后给出下列离子：m/z227,240,270和290/292。在分析虾中的该内化合物时，我们分析了Florfenicol amine，尽管在某些步骤有变化（例如：使用PRS柱），来监测该类药。但在蜂蜜中我们没有评估Florfenicol amine是否存在。试剂溶剂：乙酸乙酯，己烷，乙腈（色谱醇级）甲酸用于配备流动相固相萃取柱：C18：Varian Mega-BE C18, 1g, 6ml PRS: Varian Bond-Elut LRC-PRS 500mg 进样器滤膜：4mm滤膜

6、0.45um，PFTE，Phoenomenex P/N AFO-0422仪器：1 离子阱液质联用仪：仪器使用Finnigan LCQ DECA 离子阱质谱仪和Spectrasystem 液相色谱系统。液相系统包括一台SCM 1000 在线脱气机，P4000液相色谱泵，AS3000自动进样器，UV6000LP 紫外检测器。软件使用Xcaliber 1.2 版。2 液相色谱柱：液相色谱柱使用Xterra 苯基柱(2.1 x 100mm，3.5u，Waters 公司 P/N 186001180)。其余的苯基柱也可以接受。在我们实验室中Inertsil 苯基柱（2x150 mm, 5u , Pheno

7、menex 公司 P/N 0301-150X020） 也在方法研究中使用。如果使用其他的色谱柱，在采集程序中，时间段也应该调节以对应保留时间的漂移。3 其他旋转蒸发仪：使用冰阱和水浴设定到50°C。氮气蒸发仪：12位样品氮气蒸发仪，设定50°C水浴。塑料杯：15ml可丢弃的具有聚乙烯盖。玻璃制品：容量瓶，移液管步骤：1 配备标准溶液强化标准：单独的药品储备溶液在1000ug/ml（1000ng/ul）由乙腈配。备。 中间的标准溶液（10ng/ul）由1ml的储备溶液用乙腈稀释到100毫升。配备强化的标准品由下面方法：取0.5 ml , 0.2 ml 和0.1ml 溶液稀释到

8、10毫升的容量瓶中用乙腈分别稀释到5,2,1ppb的强化标准溶液。质谱标准：对于质谱分析，标准储备溶液100ug/ml(100ng/ul)由甲醇配 制。混合的中间标准由500ul 储备溶液由50毫升0.1%甲酸溶液（1ng/ul 每个药品）稀释而成。液质联用工作标准溶液：下面方法配置：中间标准ul 0.1%甲酸ul ng/ul 相当于蜂蜜（ppb）*1000 4000 0.2 5400 4600 0.08 2200 4800 0.04 1* 假定处理10克蜂蜜然后最终提取体积250ul。稳定性： 液质联用工作标准溶液至少有一周的稳定期2 样品制备控制样品：每次分析样品时，至少一个控制

9、样品（空白基质）样需要分 析。强化样品：每次分析未知样品时，至少两个强化样品需要分析。强化样品的浓度应该在1-5ppb间。未知样品：在方法研究阶段，没有得到。3 样品提取精确称取10.00(±0.05g)蜂蜜在一个59ml的聚丙烯的离心管里。加入10ml水，旋转/或振摇使蜂蜜完全溶解。加入20ml 乙酸乙酯，剧烈振摇一分钟。在4000转速下离心5分钟。将乙酸乙酯层转移至一个100ml 的容量瓶中。重复该步骤一次。在50度下旋转蒸发到干。加入30ml水至蒸干的容量瓶中，旋转5秒然后超声2分钟。转移至30ml聚丙烯离心管中。用5ml己烷清洗容量瓶，然后加入到离心管中。剧烈振摇离心管30秒

10、，在4000转速下离心3分钟。移去并去掉己烷层。用5ml己烷重复此步骤。将水层转移到固相萃取系统（PRS柱，在C18柱下有可选的75ml保留池），以每秒两滴的速度向下流。弃去所有的液体。当液面达到PRS柱的顶端时，加入1ml水。当液面再次到PRS柱顶端时，弃去柱。当液面到C18柱顶端时，加入2ml水。流直到弃去液体。在真空中干燥柱一分钟。用4ml甲醇洗脱柱，并洗脱至15ml聚丙烯离心管中。至干燥。用250ul0.1%甲酸将干燥的提取物溶解，并过滤准备质谱进样。 4 仪器操作参数不管使用任何仪器，一定的性能验证准则应该结合到操作参数里。这些包括质量效正、调谐和适当的断裂模式。应该按照仪器生产厂商

11、的规格或实验室内部的质谱标准操作步骤来对仪器的质量校准。信号优化（调谐）应该按照所感兴趣的离子丰度调节至最大。每日的系统适应性实验也应该满足。以下描诉的是特定的操作步骤用来验证该方法。（i）仪器配置：LC/MS 分析是在LCQ Deca 质谱仪通过电喷雾接口和TSP P4000 液相色谱连接。仪器使用正负离子检测。按照生产厂商的说明来对仪器进行调谐。在m/z 321 下调谐来优化氯霉素的响应。在调谐过程中，氯霉素（1ng/ul 在流动相中）通过蠕动泵以10ul/min 进样，然后通过色谱（250ul/min 80/20 0.1% 甲酸/乙腈）通过T型环在进入质谱离子源。在调谐文件中MS参数设置

12、为Prescan 2 和最大进样时间100ms。使用仪器的调谐功能时，MS2的参数同样也得到优化。在该参数运行下，Prescan 设置为1，最大进样时间设置为500ms。在全部的MS2离子流，和特定离子（m/z 194， 249）碰撞能量优化后没有显著性差异（在所有的情况下优化的碰撞能量为24-26%）。（ii）响应监测：使用离子阱，使用下列程序，每个分析物的MS2都使用该分析物的分子离子峰：程序1：采集固定的MS2 在进行所有的MS2时，Isolation width 设置为2amu。如果使用时间段1(Time Segment)，应该使用正离子调谐。在建立氯霉素分析的调谐文件时，其余时间段(

13、Time Segment)也采用了。Time Segment 1 2-5 min. FFA (该段可以不采用)Scan Event 1: (+)MS m/z 180-350Scan Event 2: (+)MS2 of m/z 248.1 归一化能量(CE)设定为24%m/z 65-250Scan Event 3: (+) MS3 of m/z 248.1(24%CE)®m/z230.1(32%CE)m/z60-250Time Segment 2 5-11 min TAPScan Event 1: (-)MS m/z 320-375Scan Event 2: (-)MS2 of m/

14、z 354.2 归一化能量(CE)设定为35%m/z 65-250Scan Event 3: (-) MS3 of m/z 356.2(35%CE) Time Segment 3 11-12.5 min FFScan Event 1: (-)MS m/z 320-375Scan Event 2: (-)MS2 of m/z 356.2 归一化能量(CE)设定为24% Scan Event 3: (-) MS3 of m/z 358.2(24%CE)Scan Event 4: (-) MS3 of m/z 356.2(24%CE)®m/z335.8(20%CE)Time Segment

15、 3 12.5-18 min CAPScan Event 1: (-)MS m/z 300-350Scan Event 2: (-)MS2 of m/z 321.2 归一化能量(CE)设定为24% Scan Event 3: (-) MS3 of m/z 323.2(24%CE)紫外二极管阵列检测器同时也使用了，扫描范围为190-800nm，通道A设定为270nm （带宽9nm），通道B设定为236nm（带宽为9nm）。(iii)特定的操作条件：电喷雾接口操作温度为275°C。Sheath gas 为氮气，压力大约为35psi。辅助气体为氮气压力大约为6psi(用于氯霉素信号的优化)

16、。流速为250ul/min ，不需要使用柱温箱。自动进样器进样为75ul，使用“push loop” 方式进样。在第一分钟，液相色谱从质谱仪分流。质谱仪运行1-18分钟。流动相梯度为如下：时间（分钟）%乙腈比例0.1%甲酸比例0-5*2986-18208020-22901023-28298*如果不分析florfenicol 胺，梯度程序可以从20%的乙腈开始。时间需要调整。5 样品分析步骤 每次分析样品时，标准品都必须分析（在开始分析样品和结束时，如果大量样品需要分析时在程序中间也应该分析标准品）。分析未知样品的提取物时，至少两个正性控制的样品也应该分析。分析未知样品的提取物时，空白样品（负控

17、制）也应该分析，以确保氯霉素的不存在。至少一个加强控制的样品必须满足所有的确认准则。每次样品分析后必须运行空白溶剂（流动相一次来确保没有前次样品或标准品的残留。在重复同一个样品时或使用低浓度到高浓度的加强样品时，不需要运行空白溶剂。6. 计算 对于定量分析，如果数据满足Section G2v的确认准则，最重要的因素是 或得待测物的信息。从全扫描的离子 图（m/z 对应的M-H-）到MS2 (从m/z 321 和m/z 323 断裂后对应的m/z 194 M-H-(NH2COCCl2H)- )都可以在MS2的光谱数据中。另外，321 和323 的二级质谱也可以在观察到（m/z 194, 257/

18、259, 176）。一旦扫描数据获得，从二级质谱的图谱可以估计最有代表特征的相对丰度离子。总离子流的积分不再需要。7系统适应性实验仪器应该满足以上所描述的校正和调谐准则。另外，对于每日分析来说，标准的混合物应该事先分析以确定判断准则或仪器的系统适应性。待测物应该在正确的保留时间流出；（除非色谱柱或流动相改变）如果使用了以前的标准品，保留时间应该在该标准品的±5%或在时间窗口里。如果仪器最近一段使用没有使用，需要标准品进一到两次样来判断正确的保留时间。另外，在321-194MS2的二级质谱中，1ppb的氯霉素的标准样品75ul进样后的响应值应该大于>200,000。验证信息1 验

19、证数据离子阱质谱确认蜂蜜中的氯霉素的验证数据在附录3显示。2 评估的参数1） 回收率：在2-5ppb 加强样品应该在46-66%2） 重现性：使用下列标准，分析一系列标准样品（75ul进样体积）在1ppb(柱头进样3ng)，分析氯霉素321到194的重现率为16%（n=6），在（柱头进样750pg），19.9% (n=5)，（柱头进样300pg）40.0% (n=4).3) 专一性：在分析过程中，分析了很多批蜂蜜样品，在分析的样品中使用质谱滤过后，在控制的样品中没有明显的干扰峰。4) 灵敏度：对于氯霉素分析中，离子阱仪器能够确认300-500pg柱头进样的标准品和75ul进样体积下1ppb的蜂蜜样品（最终提取的为250ul）。5）使用标准样品 的回收的准确性和准确度使用离子阱仪器，阳性确认必须满足下列准则。对于氯霉素：1）从母离子（m/z 321 和323）得到的二级质谱中， 必须观察到m/z 194 M-H-(NH2COCCl2H)-，而且该离子在质量数范围（）必须是基峰。2）另外，在外标法中，至少下列结构类似的离子（m/z 257 /259 M-H-(HCOCl)-，m/z 24