酶制剂对刺参生长、免疫能力及氨氮胁迫下免疫酶活力和热休克蛋白70表达量的影响

1、酶制剂对刺参生长、免疫能力及氨氮胁迫下免疫酶活力和热休克蛋白70表达量的影响武明欣1,2 王际英2 李宝山2 张德瑞3 王世信3 孙永智2 张利民2收稿日期：2014-11-12基金项目：国家海洋生物产业-水生动物营养与饲料研发创新示范平台资金（201403003），山东省现代农业产业技术体系刺参产业创新团队建设项目(SDAIT-08-011-08)作者简介：武明欣（1988-），女，山东东营人，硕士研究生，研究方向为水产动物营养与饲料。手机E-mail：08wumingxin*通讯作者：张利民，研究员，硕士生导师，E-mail：ytzlm（1.上海海洋大学水产与生命

2、学院，上海 201306；2.山东省海洋资源与环境研究院，烟台 264006；3.山东升索渔用饲料研究中心，烟台 265500）摘 要：（目的）本试验旨在研究不同酶制剂对刺参生长、体成分、免疫能力及氨氮胁迫下免疫酶活力和热休克蛋白70表达量的影响。（方法）在基础饲料中分别添加木聚糖酶、纤维素酶、淀粉酶及其复合酶，配制5组粗蛋白含量为20%的实验饲料（D1，D2，D3，D4，D5，D1为对照组，不添加酶制剂），饲喂初始体重（4.02±0.04）g的刺参幼参56d。（结果）结果表明：添加组刺参增重率和特定生长率均显著高于的D1组（P<0.05），D2-D5组增重率分别比D1组提高了

3、18.74%、9.05%、3.17%和22.02%；添加木聚糖酶显著提高了体壁粗蛋白的含量，添加纤维素酶、淀粉酶和复合酶显著提高了体壁粗蛋白、粗脂肪和粗灰分的含量（P<0.05）；添加酶制剂显著提高了体腔液溶菌酶、超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活力，其中D4组溶菌酶、超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活性分别比D1组提高了54.71%、7.68%和47.33%；120h氨氮胁迫过程中，各组体腔液溶菌酶、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶活力及热休克蛋白70表达量呈先上升后下降趋势，且添加组高于对照组。（结论）综上，饲料中添加酶制剂能显著提高刺参生长性能，改善体成分，提高免疫性能和抗病力，木聚糖酶的促生长作用

4、更显著，而淀粉酶的促免疫作用更显著。关键词：刺参；酶制剂；生长；免疫；氨氮胁迫；热休克蛋白70中图分类号：文献标识码： 文章编码： 饲用酶制剂是一种以酶为主要功能性因子，通过特定生产工艺加工而成的饲料添加剂1。饲用酶制剂可刺激内源消化酶分泌，降低肠道食糜黏度，提高饲料转化率2；减少或消除饲料中的抗营养因子；提高机体免疫抵抗能力，促进水产动物健康生长1。目前，酶制剂在饲料中的应用主要集中于畜禽方面,在水产饲料中的应用仅见于草鱼3-4、异育银鲫5-6、尼罗罗非7、大黄鱼8-9等少数种类，在刺参上的应用还未见报道。刺参属海参纲（Holothuroidea），海参科（Holothuriidae）。近年

5、来随着刺参食用和药用价值不断被发现10，其越来越受到养殖者和消费者青睐。随着刺参养殖规模的扩大，各种病害及环境胁迫影响也愈渐显著，给刺参养殖业带来巨大损失。酶制剂作为一种绿色环保、无药物残留的新型饲料添加剂，可有效提高养殖动物的生长性能和疾病抵抗能力，得到了许多研究者的关注11。本实验研究了几种单体酶及其复合酶对刺参生长、体成分、免疫能力及氨氮胁迫下免疫酶活力和热休克蛋白70表达量的影响，以期为酶制剂在刺参配合饲料中的应用提供基础数据，促进绿色饲料添加剂的发展。1 材料与方法1.1 试验设计 实验分为5个处理，分别为对照组、木聚糖酶组、纤维素酶组、淀粉酶组和复合酶组，每个处理3个重复，每个重复

6、放养体重（4.02±0.04）g的幼参40头。实验所用木聚糖酶、纤维素酶由武汉新华扬生物股份有限公司提供，淀粉酶购于国药集团化学试剂有限公司，酶活力分别为10 000U/g、1 000U/g、2 000U/g。分别以酶制剂（0%）、木聚糖酶（0.04%）、纤维素酶（0.1%）、淀粉酶（0.01%）和复合酶（木聚糖酶，纤维素酶和淀粉酶分别为0.04%，0.1%和0.01%）等量替代配方中的-淀粉，配制粗蛋白含量为20%的5种实验饲料，命名为D1、D2、D3、D4、D5。饲料配方及营养组成见表1。固体原料超微粉碎过200目标准筛，按配比称重，加入新鲜鱼油及适量蒸馏水混匀，用小型颗粒饲料挤

7、压机制成直径为0.3cm的颗粒，60烘干，用小型粉碎机破碎，筛选粒度在80100目之间的颗粒备用。表1 试验饲料组成及营养水平（风干基础）Table 1 Composition and nutrient level of experimental diets(air-dry basis) %项目组别 GroupsItemsD1D2D3D4D5鱼粉Fish meal1010101010豆粕 Soybean meal1515151515藻粉 Alge powder2020202020小麦粉 Wheat flour1515151515海泥 Sea mud 2525252525-淀粉-starch9.

8、59.469.49.499.35木聚糖酶 Xylanase1)00.04000.04纤维素酶 Cellulase1)000.100.1淀粉酶 Amylase1)0000.010.01鱼油 Fish oil11111磷酸二氢钙 CaH2PO411111黏合剂Binder0.50.50.50.50.5维生素预混料 Vitamin premix2)22222矿物质预混料 Mineral premix3) 11111合计 Total100.00100.00100.00100.00100.00营养水平 Nutrient levels粗蛋白质 CP20.9920.6520.6620.6120.74粗脂肪

9、EE1.661.611.721.691.83粗灰分 Ash29.232928.6828.9228.97能量 Gross energy/(KJ/g)10.6910.6510.6711.0110.941)添加量为推荐添加量。2)每千克维生素预混料含 One kilogram of vatamin premix contained the following: VA 38.0 mg，VB12 1.3 mg，VD3 13.2 mg，核黄素 riboflavin 380.0 mg，硫胺素 thiamine 115.0 mg，-生育酚 -tocopherol 210.0 mg, 烟酸 nicotinic

10、acid 1030.0 mg，泛酸 pantothenic acid 368.0 mg，生物素 biotin 10.0 mg，叶酸 folic acid 20.0 mg，抗坏血酸 ascorbic acid 500.0 mg，盐酸吡哆醇 pyridoxine hydrochloride，HCl 88.0 mg，肌醇 inositol 4000.0 mg。 3)每千克矿物质预混料含 One kilogram of mineral premix contained the following: KCl 3020.5 mg，KAl(SO4)2 11.3 mg，NaCl 100.0 mg，KI 7.5

11、mg，NaF 4.0 mg，ZnSO4·7H2O 363.0 mg，CuSO4·5H2O 8.0 mg，MgSO4·7H2O 3568 mg，MnSO4·4H2O 65.1 mg，Na2SeO32.3 mg， NaH2PO4·2H2O 25558.0 mg，CoCl2 28.0 mg，C6H5O7Fe·5H2O,1523.0 mg，Ca-lactate 15978.0 mg。1.2 饲养管理饲养试验在山东省海洋资源与环境研究院东营实验基地循环水养殖系统中进行，实验用参为该基地当年繁育的同一批参苗。实验开始前，1000头刺参幼参放养于养

12、殖系统中，暂养15d，期间投喂基础饲料，待其完全适应饲养条件后，选择体质健壮、体重（4.02±0.04）g的刺参幼参720头，平均放养于15个圆柱形玻璃钢养殖桶中。每种饲料随机投喂3个养殖桶。试验在微流水环境中进行，采用充气增氧，保证溶氧>7mg/L，控制水温在18-20，pH7.8-8.2，盐度24-26，亚硝酸氮、氨氮均0.05mg/L。养殖试验持续56d，每天投喂2次（8:00,16:30），日投喂量为刺参体重的2%，根据实验刺参摄食情况及时调整投喂量。每隔两天换水一次，换水时用虹吸法将残饵及粪便吸出。1.3 样品收集实验结束后，禁食48h，测量每桶刺参总数和总重后，每桶

13、随机取10头刺参，用滤纸轻轻吸干体表水分，称体重，待其自然舒展后量体长，用于特定生长率和肥满度的计算。用2ml 无菌注射器抽取体腔液后，置冰盘上解剖，分别称量体壁与肠道质量，并测量肠道长度。体腔液在 3000 r/min ，4，离心 15 min，取上清液分装于 2ml 的离心管中，-80保存，用于测定酶活。1.4 氨氮胁迫试验样品收集后，封闭循环水系统，用NH4Cl调节养殖水氨氮浓度约为5mg/l，继续饲养实验刺参5天，并分别在实验的0h、24h、48h、72h、96h、120h采集实验刺参的体腔液，用于免疫酶活力和热休克蛋白（HSP）70表达量的测定。1.5 测定指标和方法1.5.1 生长

14、指标成活率（SR,%）=试验末参总数 / 试验初参总数×100；增重率（WGR, %）=（试验末参总重 试验初参总重）/ 试验初参总重×100；特定生长率（SGR, %/d）=（ln试验末平均参重 ln试验初平均参重）/ 试验天数×100；肥满度（CF, %）= 体重 / 体长3×100；脏体比（VSI, %）= 内脏重 / 参体重×100；肠体比(VIR,%)=肠重/参体重×100；肠长比(RIL,%)=肠长/体长×1001.5.2 饲料及体壁营养成分的测定饲料及体壁营养成分含量采用常规方法测定：干物质采用105烘干至恒重

15、（GB/T6435-2006）；粗蛋白质采用杜马斯燃烧法（Leco FP528）；粗脂肪采用索氏抽提法(GB/T6433-1994)；粗灰分采用550 马福炉灼烧法（GB/T6438-2007），能量采用燃烧法（PARR，6100）。1.5.3 免疫酶活力的测定溶菌酶（LZM）活性采用空白对照比浊法测定，总超氧化物歧化酶（T-SOD）采用羟胺法测定，过氧化氢酶（CAT）采用可见光分光光度计法测定，以上指标均采用南京建成生物工程研究所的试剂盒进行测定。1.5.4 HSP70的测定HSP70采用上海拜沃生物科技有限公司的试剂盒进行测定。实验采用酶联免疫吸附法（ELISA）。将标准品、待测样品加入到

16、纯化的海参HSP70单克隆抗体包被的微孔板中，加入酶联亲和物，37孵育60分钟，洗涤除去未结合的成分。依次加入底物A和B，底物（TMB）在辣根过氧化物酶（HRP）催化下先转化为蓝色后变为黄色。在450nm波长下测定OD值，根据标准品和样品的OD值计算样品中热休克蛋白70的含量，以pg/ml表示。1.6 数据统计实验所得数据采用Microsoft Excel 2007及SPSS®(SPSS, Inc, Chicago, IL) 11.0软件进行单因素方差分析(one-Way ANOVA，LSD)，结果以平均值±标准偏差(±SD)表示，差异显著(P<0.05)时

17、用Duncans检验进行多重比较分析。2 结果2.1 添加酶制剂对刺参生长性能的影响由表2可见，添加木聚糖酶、纤维素酶、淀粉酶和复合酶均能显著提高刺参的增重率和特定生长率（P<0.05），且添加木聚糖酶和复合酶的促生长效果更明显，其增重率与对照组相比分别提高了18.74%和22.02%。添加木聚糖酶组脏体比和肠长比均显著高于对照组（P<0.05），添加纤维素酶组脏体比显著高于对照组（P<0.05），添加淀粉酶组肥满度显著高于对照组（P<0.05），添加复合酶组肥满度、脏体比、肠体比和肠长比均显著高于对照组（P<0.05）。添加复合酶对存活率也有一定提高，但影响不显

18、著（P>0.05）。表2 添加酶制剂对刺参生长性能的影响 Table2 Effects of dietary enzyme on growth performance of Apostichopus japonicus项目Items组别GroupsD1D2D3D4D5初体重 IBW/g4.02±0.084.03±0.024.01±0.044.04±0.054.02±0.03终体重 FBW/g4.49±0.04a5.19±0.07c4.80±0.02b4.56±0.09a5.32±0.14c

19、增重率 WGR/%10.91±0.75a29.65±1.86d19.96±1.21c14.08±1.53b32.92±0.65e特定生长率 SGR/(%/d)0.18±0.00a0.46±0.00d0.32±0.00c0.23±0.01b0.51±0.00e肥满度CF/%5.61±0.17a5.53±0.12a5.57±0.10a5.97±0.11b5.89±0.11b脏体比VSI/%7.04±0.59a7.53±0.47b8

20、.14±0.38b7.12±0.60ab7.81±0.50b肠体比VIR/%4.45±0.58a4.90±0.64ab5.00±0.36ab4.85±0.51a5.78±0.35b肠长比RIL/%2.55±0.24abc2.77±0.21bc2.53±0.08abc2.40±0.22ab2.88±0.22c存活率 SR/%96.67±5.7796.67±1.4496.67±2.8993.33±2.8998.33±2.

21、89 同行无字母或数据肩标相同字母表示差异不显著(P0.05)，不同小写字母表示差异显著(P0.05)，不同大写字母表示差异极显著(P0.01)。下表同。In the same row, values with no letter or the same letter superscripts mean no significant difference (P0.05), while with different small letter superscripts mean significant difference (P0.05), and with different capital l

22、etter superscripts mean significant difference (P0.01). The same as below.2.2 添加酶制剂对刺参体壁基本成分的影响由表3可见，添加不同酶制剂对刺参体壁水分含量无显著影响（P>0.05）。但添加木聚糖酶、纤维素酶、淀粉酶和复合酶均显著提高了体壁粗蛋白的含量（P<0.05）。添加淀粉酶和复合酶显著提高了体壁粗脂肪的含量（P<0.05）。添加纤维素酶、淀粉酶和复合酶显著提高了体壁粗灰分的含量（P<0.05）。表3 添加酶制剂对刺参体壁基本营养成分的影响 Table3 Effects of dietar

23、y enzyme on nutrition composition of body wall of Apostichopus japonicas %项目Items组别GroupsD1D2D3D4D5水分 Moisture90.44±0.1890.58±0.2990.56±0.1990.80±0.2390.79±0.29粗蛋白a Crude protein47.82±0.60a51.13±0.74b52.94±0.27b52.59±0.48b52.71±0.94b粗脂肪 a Crude lipid

24、 2.57±0.18a2.63±0.19a2.65±0.15a3.80±0.21c3.06±0.12b粗灰分a Ash29.53.±0.05a29.51±0.14a30.70±0.19b30.58±0.14b31.68±0.08c注：a为干基含量。Note: a is dry basis content.2.3 添加酶制剂对刺参免疫能力的影响由表4可见，添加不同酶制剂对刺参免疫能力均有提高作用。添加木聚糖酶、纤维素酶和复合酶显著提高了过氧化氢酶的活力（P<0.05）；添加淀粉酶组溶菌酶、超

25、氧化物歧化酶、过氧化氢酶活力均有显著提高（P<0.05）。溶菌酶和超氧歧化酶活力均以添加淀粉酶组最高，且显著高于其他各组（P<0.05）。表4 添加酶制剂对刺参免疫酶活力的影响Table4 Effects of dietary enzyme on immune enzyme activity of Apostichopus japonicus项目Items组别GroupsD1D2D3D4D5溶菌酶LZM/（U/ml）67.59±6.05a69.22±6.28a63.45±4.33a83.25±8.94b72.17±7.38ab超氧化

26、物歧化酶SOD/ (U/ml)113.04±6.35a109.65±8.24a111.94±4.32a121.72±3.84b113.89±4.04a过氧化氢酶CAT/（U/ml）1.50±0.02a1.69±0.02b1.88±0.04c2.21±0.10d2.32±0.03d2.4 添加酶制剂对氨氮胁迫下刺参免疫酶活力和HSP70的影响由图1可见，氨氮胁迫过程中各实验组溶菌酶活力均呈先升高后降低的趋势。各组溶菌酶活力最大值分别出现在72h、72h、96h、96h和96h。其中，D4和D5组最

27、大值显著高于其余各组（P<0.05）。各实验组SOD活力均呈现先升高后降低的趋势。各组SOD活力均在24h达到最大值，之后降低并于48h后趋于稳定，且其稳定值略低于初始值。各实验组CAT活力均呈现先升高后降低的趋势。各组CAT活力均在96h达到最大值，其中D4组最大值显著高于其他各组（P<0.05）。实验初期D5组HSP70表达量明显高于其他各组。D2组刺参体腔液HSP70的表达量呈现一直升高的趋势，其余各组均呈现先升高后降低的趋势。D5组体腔液HSP70表达量比其他实验组率先达到最高点，且在96h后趋于稳定。D1、D3和D4组HSP70表达量于96h达到最大值。除D2外，其余加酶

28、组HSP70表达量最大值均高于对照组。图1氨氮胁迫过程中刺参体腔液LSM、SOD、CAT活力及HSP表达量的变化Fig. 1 Changes of LSM、SOD、CAT activity and Heat Shock Protein 70 Content under the stress of ammonia nitrogen of Apostichopus japonicus3 讨论3.1 饲料中添加酶制剂对刺参生长性能和体成分的影响本研究表明，饲料中添加酶制剂显著提高了刺参的增重率和特定生长率，这与在鲫鱼12、尼罗罗非鱼13-15、黄河鲤16和大西洋鲑上17的研究结果相一致。添加酶制剂促

29、进刺参生长，主要有以下几方面原因：1）饲料中添加木聚糖酶能有效降低肠道食糜黏度，降解非淀粉质抗营养因子，提高养殖动物对营养物质的消化吸收，从而改善养殖动物的生产性能18,19。2）纤维素酶能破坏细胞壁、降低饲料密集粘度，同时刺激内源酶的分泌，从而提高水产动物对营养成分的消化吸收20。3）饲料中添加淀粉酶起作用的主要为 -淀粉酶和糖化酶。-淀粉酶为内切酶，将淀粉大分子水解成易溶解的中等和低分子物质，有利于糖化酶的水解。糖化酶为内切酶，其活性的高低直接影响到动物的生长21。4）复合酶综合了几种单体酶的作用，又不仅仅是单个酶作用的复合。邓岳松22等在研究中发现由纤维素酶、淀粉酶、蛋白酶等组成的复合酶

30、对饲料中的一些抗营养因子具有灭活作用,可消除鱼对营养物质的消化和吸收困难，从而提高鱼体生长性能。黄峰23等研究表明，添加复合酶促进异育银鲫生长的效果稍好于单一添加木聚糖酶，这可能得益于复合酶的叠加效应和协同效应。本试验结果也表明，添加复合酶的效果优于添加单体酶。 本研究表明，添加酶制剂对刺参体壁粗蛋白、粗脂肪和粗灰分均有显著影响。这与王俊丽13、黄燕华24等的研究结果相一致。饲料中添加木聚糖酶能促进肠道蛋白酶活力，增加肠道内游离氨基酸和小肽数量，从而促进蛋白质和合成和积累。同时，添加木聚糖酶降低了肠道食糜黏度，肠道活动增强，从而促进了对脂肪的吸收，增加了体壁中脂肪的沉积。添加木聚糖酶使肠道中低

31、聚木糖增加，低聚木糖的代谢降低了肠道PH值，增强了钙盐的溶解性，促进了钙的吸收，从而提高了粗灰分的含量13。而钟国防7、张璐8等的研究证明，添加酶制剂对养殖动物基本营养成分均无显著影响。这可能与添加酶的种类、活力及养殖动物种类有关。3.3 饲料中添加酶制剂对刺参免疫能力的影响溶菌酶是重要的非特异性免疫指标之一，它主要对革兰氏阳性菌发挥作用，其活性的高低直接反映出溶菌能力的强弱25。刺参同鱼类相似，没有完善的特异性免疫，因此溶菌酶在其免疫方面比哺乳动物起着更重要的作用26。超氧化物歧化酶是一种重要的抗氧化酶，在防止机体衰老和抗分子损伤方面有重要作用，它与生物体免疫水平密切相关27。过氧化氢酶是生

32、物体内抗氧化作用重要的保护酶，起着催化H2O2分解，保护生物体组织免受损害的作用28。本试验研究结果表明，添加酶制剂对各免疫指标均有促进作用。添加木聚糖酶组，其溶菌酶和过氧化氢酶活性与对照组相比有显著提高。添加淀粉酶组，其溶菌酶、超氧化物歧化酶及过氧化氢酶活力均有显著提高。这与黄燕华24、钟国防15、黄峰5,6等人的研究结果一致。黄燕华等研究证明，添加淀粉酶能显著提高对虾血清超氧化物歧化酶活力。钟国防15等研究表明，在尼罗罗非鱼饲料中添加木聚糖酶和复合酶能显著提高鱼体肝脏和脾脏中超氧化物歧化酶和溶菌酶活力。添加酶制剂提高了水生动物的消化吸收能力，特别是对蛋白质及其他营养成分的利用率，从而也促进

33、了相关免疫因子的合成，产生了更多的O2-自由基，提高了养殖动物免疫和抗氧化能力。3.4 饲料中添加酶制剂对氨氮胁迫下刺参体腔液免疫酶和HSP70的影响热休克蛋白是一种应激反应的指示器，它能使细胞处于保护状态，它的产生能使细胞抵抗致死性损伤，增强细胞对外界损害的耐受力28。本试验过程中，在5mg/L的氨氮浓度胁迫下，各实验组免疫酶活力均表现出一定的上升趋势。这说明，短时间内合适的氨氮浓度能增强刺参的免疫性能，这主要是由于氨氮胁迫增强了刺参体内水解系统的活性，表现出明显的毒物兴奋作用29。本试验研究发现，添加酶制剂能促进刺参免疫性能，因此在短时间内各添加组表现出比对照组更迅速和强烈的免疫抵抗反映。

34、随着胁迫时间的延长，刺参自身的水解系统活性降低，抵抗力下降28，因此各实验组免疫酶活性随后表现出下降趋势。72h内各实验组刺参体腔液HSP70表达量均呈上升趋势。这说明，刺参通过提高HSP70的表达量，增强抗逆性，以适应氨氮胁迫的环境28。氨氮胁迫开始前（即0h），D5组HSP70的表达量明显高于其余实验组，其次为D2组。这说明，酶制剂本身就有一定的胁迫作用，诱导机体HSP70的表达，以起到保护细胞和抵抗损伤的作用，且各酶协同作用的效果远远高于单一酶作用。48h内，D3、D4、D5组HSP70表达量与D1组相比表现出较快的升高，且D5更早的达到最高点。这可能与添加酶制剂有利于促进刺参自身免疫和

35、胁迫抵抗有关。4 结论本试验研究表明，饲料中适量添加木聚糖酶、纤维素酶、淀粉酶和复合酶能提高刺参幼参的增重率、特定生长率以及免疫性能，并对刺参体壁粗蛋白、粗脂肪和粗灰分的含量也有一定影响，且木聚糖酶的促生长作用更明显，而淀粉酶的促免疫作用更明显。参考文献：1 明建华.酶制剂在水产动物饲料中的应用J.饲料工业,2007 ,28(10):17-19.2 Inborr J.Practical application of feed enzymeJ.Feed Compounder,1993(10):41-49.3 黄峰,施培松,文华等.外源酶对草鱼鱼种生长及饲料表观消化率的影响J.安徽农业科学,200

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44、gen of sea cucumbers(Apostichopus japonicus)WU Mingxin1,2 ZHANG Limin2 LI Baoshan2 ZHANG Derui3 WANG Shi-xin3 SUN Yong-zhi3 WANG Ji-ying2(1. College  of  Fisheries  and Life Science, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China; 2. Shandong Provincial Key Labo

45、ratory of Restoration for Marine Ecology, Shandong Marine Resourse and Environment Research Institute, Yantai, Shandong 264006, China; 3. Shengsuo Fishery Feed Research Centre of Shandong Province, Yantai, Shandong 265500, China)Abstract: (Objective)A 56-day feeding trial was conducted to evaluate the effect of several different enzymes on growth performance, body composition, immunity capabilities, and immune enzyme activities and heat shock protein 70 content under the stress of ammonia nitrogen of sea cucu