小鼠胸腺树突状细胞的形态学观察

1、    小鼠胸腺树突状细胞的形态学观察        【摘要】目的观察小鼠胸腺树突状细胞(TDC)的形态。方法密度梯度离心结合小鼠CD5单抗淘洗法(panning)，分离出小鼠TDC并行光镜及电镜观察。结果台盼蓝排斥试验示90%以上细胞存活。光镜下发现初分离的TDC常和周围的胸腺细胞形成紧密的细胞簇。S-100蛋白染色见 TDC胞体和突起内有棕黄色反应产物。ANAE反应呈阴性或在核附近有数个小颗粒反应。ATP酶反应阴性。电镜见细胞表面有许多树状突起，核形不规则，胞质电子密度低

2、，有丰富的线粒体、核糖体及完整的高尔基复合体。结论所分离的TDC具有典型的树突状细胞的形态学特征。【关键词】树突状细胞；胸腺；细胞化学；电镜；小鼠【中分类号】+3【文献标识码】A【文章编号】0529-1356(2000)04-375 THE MORPHOLOGY STUDY OF MOUSE THYMICDENDRITIC CELLSDING Bei-beiMIAO Ji-wuYANG NingYIN Lan-zhen（Department of Histology and Embryology）SONG Ji-zhi（Laboratory of Electron Microscope, Na

3、njing Railway Medical College, Nanjing 210009, China）【Abstract】Objective To observe the morphology of mouse thymic dendritic cells(TDC). Methods TDCs were isolated from thymic suspension by Ficoll-Hypaque gradients and Percoll gradients of different densities followed by Panning procedure with anti-

4、CD5 monoclonal antibodies. The cells in the TDC-enriched fraction were assayed. Results There were more than 90% of surviving cells in this fraction. It was found that TDC could contact and cluster with thymocytes. S-100 reaction product was detected primarily in the cytoplasm and cytoplasmic proces

5、ses of these cells. In the ANAE reaction, some cells were negative, and some contained small cluster of positive tiny granules located closely to the nucleus. The ATPase activity was negative. Most cells exhibited many bulbous protrusions. The nucleus was irregular in shape. The cytoplasm was often

6、electron-lucent, but contained large amount of free ribosomes, mitochondria and well-developed Golgi complexes. Conclusion The obtained TDCs had the classical morphology of dendritic cells.【Key words】 Dendritic cells; Thymus; Cytochemistry; Electron microscope; Mouse树突状细胞是一种重要的免疫辅助细胞，对T细胞免疫反应的建立起着至关

7、重要的作用。胸腺树突状细胞(thymic dendritic cell, TDC)能较强地递呈各种内源性及外源性抗原，促进胸腺细胞增殖、刺激混合淋巴细胞反应；参与胸腺细胞的阴性选择、形成自身免疫耐受，与自身免疫性疾病有密切关系。TDC含量极少，占胸腺细胞总数的0.05%0.07%1，原位研究较困难，很有必要做分离培养体外研究。本研究采用Percoll密度梯度离心结合小鼠CD5单抗淘洗法(Panning)分离出小鼠TDC，并对分离的细胞进行光镜及电镜观察，为进一步研究其功能提供形态学资料。材料和方法1. 动物昆明种小鼠40只，5周龄，体重介于2025 g之间，雌性。2. 主要试剂胶原酶(型，Si

8、gma)，Ficoll-Hypaque分离液(1.0781.080)，Percoll分离液(Pharmacia)，RPMI 1640培养液(Gibco),verapamil(江苏兴化制药厂)，大鼠抗小鼠CD5单抗(Sigma),兔抗牛S-100蛋白抗体(Dako)，-醋酸萘酯(Sigma)，ATP(Sigma)。3. TDC分离纯化小鼠颈椎脱臼致死，取胸腺用分离针拨成1mm3组织块，置含胶原酶1.6 g/L消化液中，37，60 min。洗去消化液，在细胞悬液中加verapamil(5×10-2g/L)使细胞进一步分散。依次进行Ficoll密度梯度离心及Percoll密度梯度离心(1.

9、078、1.062)，细胞浓度分别为1.0×107/ml及1.5×107/ml。用浓度为25 mg/L小鼠CD5单抗包被96孔克隆板，加入浓度为0.5×107/ml细胞悬液，室温静置1h。轻轻吹下未粘附的细胞即为进一步纯化的TDC。详见参考文献5。4. 光镜标本制备4.1瑞氏染色：瑞氏染液固定1 min，加蒸馏水混匀，染色10 min，流水冲洗。4.2S-100蛋白免疫染色(ABC法)：细胞涂片经冷丙酮固定后，用0.3%的过氧化氢甲醇溶液去除内源性过氧化物酶，以1.5%的正常羊血清封闭，第一抗体为兔抗牛S-100蛋白(1：200)，37 孵育60 min，二抗为生

10、物素化羊抗兔IgG(1200)，作用30 min，亲和素及生物素-辣根过氧化物酶复合物(1100)结合30 min，H2O2、DAB显色。以大鼠颌下腺石蜡切片作阳性对照。苏木素复染5 min。4.3ANAE染色：孵育液pH：6.40，37 ，3 h，水洗。2%甲基绿复染10 min。抽去底物以蒸馏水作对照。4.4ATP酶染色：孵育液pH：5.00，37 ，2 h，分别经醋酸及硫化铵各作用1 min，水洗。甲基绿复染10 min。抽去底物以蒸馏水作对照。5. 电镜标本制备将纯化的细胞悬液弃上清加入2%多聚甲醛-2.5%戊二醛电镜固定液并将细胞打散，作用45 min后，再以1 800×g

11、离心10 min。锇酸后固定，逐级丙酮脱水，Epon812包埋，超薄切片(50nm)，醋酸铀-枸橼酸铅染色，H-600型电镜观察。结果和讨论1. 光镜下观察光镜下台盼蓝排斥试验，细胞活率在90%以上。1.1瑞氏染色见细胞体积较大，核形态不规则(1)。1.2S-100蛋白免疫染色：初分离的TDC常和周围的胸腺细胞形成紧密的细胞簇(2)。胞质和突起内呈现弥漫或颗粒状棕黄色反应产物者为S-100蛋白阳性细胞(即TDC)，占细胞总数的75%90%(3)。1.3ANAE染色：单核细胞和T细胞呈阳性，见胞质内有弥散状或颗粒状红色反应物：TDC呈阴性或在核附近有数个小颗粒反应(4)。1.4ATP酶染色：所有

12、细胞均呈阴性。2. 电镜下观察电镜下TDC如淋巴细胞大小或稍大，形态不规则，有较多树状突起。核形不规则，核周可见少量异染色质(5)。胞质电子密度低，含丰富的游离核糖体及高尔基复合体，有数量不等的管泡状结构，未见溶酶体、张力原纤维、桥粒及伯贝克颗粒(Birbeck granule,BG)(6)。从观察结果可看出，TDC和外周树突状细胞有很多相似之处，主要有：(1)形态学特征：细胞形态不规则，有较多细长的突起；核质比例大，核形态不规则，胞浆内富含游离核糖体、线粒体，有完整的高尔基复合体。(2)组织化学染色特征：两者S-100蛋白染色均呈阳性；ANAE染色阴性或弱阳性；ATP酶染色阴性。然而，TDC

13、还有其特殊性。(1)TDC含量甚少，仅占胸腺细胞总数的0.05%0.07%1。(2)TDC更易与周围的胸腺细胞形成细胞簇2，正是这些细胞簇的形成构成了TDC阴性选择功能的形态学基础。(3)已证实外周树突状细胞(如朗罕细胞等)存在伯贝克颗粒，而伯贝克颗粒是否存在于TDC中，还有待进一步研究。实验中发现无论在体内还是体外，TDC极易与周围的胸腺细胞形成紧密的细胞簇，与国外报道一致2。目前认为，细胞簇的形成与胸腺细胞的阴性选择有关2。近年来发现胸腺细胞表面分子与TDC表面配体形成许多分子对(molecular couple)，如细胞内粘附分子1(intercellular adhesion mole

14、cule 1, ICAM-1)-淋巴细胞功能相关分子1(leukocyte function-associated molecule,LFA-1)、Fas(apo-1,CD95)-FasL及CD40-CD40L等。目前猜想这些分子对与协同刺激的调节、处女型T淋巴细胞的激活、一些免疫反应的启动(如MHC限制性T淋巴细胞的致敏)、抗感染及抗肿瘤、器官移植物的排斥以及T细胞依赖性抗体的形成等都有密切关系3。所以，进一步弄清细胞簇形成的分子机制及其相应的功能具有十分深远的意义。目前对TDC是否存在伯贝克颗粒仍存在争论。伯贝克颗粒是细胞膜结构的延伸，曾被认为是郎罕细胞所特有的细胞器，与受体介导的细胞摄粒

15、作用有关。我们分离的小鼠TDC未见伯贝克颗粒。考虑原因主要为：幼稚树突状细胞(如郎罕细胞)需要伯贝克颗粒发挥其摄取和处理抗原功能，而成熟树突状细胞(如TDC等)的功能主要表现为抗原递呈，此时伯贝克颗粒呈“废用性消失”4。分离获得的细胞90%以上仍然存活，S-100蛋白检测TDC纯度达75%90%，说明分离方法切实可行，详细步骤见另文5。郭仁强教授为本文提出宝贵意见，特此致谢!本文16见插第15页    1瑞氏染色观察细胞形态。箭头示TDC，见细胞体积较大，核形态不规则。标尺示20mFig.1 Wright staining of fresh isolat

16、ed cells. Note large cell with irregular nucleus().Bar=20m    2初分离细胞S-100蛋白免疫染色，见TDC和胸腺细胞聚集成簇，形成“花环”。中间()为TDC，其四周()为胸腺细胞。标尺示10mFig.2 S-100 protein staining of fresh isolated cells. TDC()contact and cluster with thymocytes(),formed thymic rosettes. Bar=10m    3

17、分离细胞S-100蛋白免疫染色，苏木素复染。见TDC()呈阳性，其四周的胸腺细胞()呈阴性。标尺示10mFig.3 S-100 protein staining of enriched cells, counterstained with haematoxylin. TDC()appeared positive while the thymocytes() appeared negative. Bar=10m    4ANAE染色示TDC呈阴性或弱阳性反应()，巨噬细胞呈强阳性反应()。标尺示10mFig.4 Acid non-specific este

18、rase staining of enriched cells. Three TDC() appeared negative or contained small cluster of positive tiny granules located closely to the nucleus while the macrophages() are intensely stained. Bar=10m    5电镜下示TDC有细长的突起()，核不规则，胞浆内见较多的线粒体及游离核糖体。标尺示1mFig.5 Ultrastructural micrograp

19、h of a TDC. Note several cytoplasmic processes () and a large, very irregular nucleus. The cytoplasm was electron-lucent, but contained large amount of free ribosomes and mitochondria. Bar=1m    【作者简介】丁蓓蓓(1972)，女(汉族)，江苏沭阳人，博士，现在上海市计划生育研究所生殖生物学研究室，邮政编码：200032丁蓓蓓（南京铁道医学院组织学胚胎学教研室）缪继武（南京铁道医学院组织学胚胎学教研室）宋继志（电镜室，南京210009）杨宁（南京铁道医学院组织学胚胎学教研室）尹兰珍（南京铁道医学院组织学胚胎学教研室）参考文献1Ardavin C, Shortman K. Cell surface marker analysis of mouse thymic dendritic cellsJ. Eur J Immu