实验性脾气虚大鼠血清胃泌素、胃窦G细胞的变化及黄芪建中汤的干

1、实验性脾气虚大鼠血清胃泌素、胃窦G细胞的变化及黄芪建中汤的干                         作者：郑小伟 包素珍 王颖 宋红【摘要】 目的探讨脾气虚证大鼠血清胃泌素（gastrin，GAS）、胃窦黏膜胃泌素分泌细胞（G）的变化及黄芪建中汤的干预作用。方法以三因素复合的方法复制脾气虚证大鼠模型，随后分别以黄芪建中汤低、中、高剂量对脾气虚大鼠进

2、行复健，在干预后不同时间段，分别检测血清木糖浓度、血清肌酸磷酸激酶活性、血清GAS水平及胃窦G细胞等指标。结果随用药时间的延长，各用药组上述指标逐步恢复；中、高剂量组用药21天时，与同期模型组比较，差异有显著性（P0.05或P0.01）；其中，高剂量组对G细胞数的改善作用，优于中剂量组（P0.05）。结论脾气虚证胃窦G细胞数量减少，释放GAS减少，血清GAS水平降低；黄芪建中汤对脾气虚大鼠有可靠的治疗作用，中、高剂量均为有效用药浓度，尤以高剂量更为理想。 【关键词】 脾气虚证；大鼠；胃窦；胃泌素；G细胞；黄芪建中汤有关脾虚证与胃泌素的关系是近年来研究的热点，比较一致的看法是胃泌素与脾虚证关系密

3、切。但是，在此研究方面，国内外大多局限于血清放免方面的研究，且结论各家报道不一。本研究以三因素复合（大黄法、游泳力竭法、饥饿法）的方法制作脾气虚证大鼠模型，对其血清胃泌素（gastrin，GAS）及胃窦黏膜胃泌素分泌细胞（G细胞）进行比较研究，从神经内分泌与免疫细胞化学相结合的角度，来探讨脾气虚证与胃泌素及其分泌细胞的关系。此外，研究设计选用经方黄芪建中汤为工具药对脾气虚证动物模型进行复健，在验证模型成功的基础上，进一步探讨经方治疗该证的可能机制，为进一步临床使用提供理论依据。1 材料与方法1.1 动物及分组 清洁级Wistar大鼠136只，雌雄各半，体重（180±20）g，鼠龄8周

4、，由浙江中医药大学实验动物中心提供。实验前先饲养观察3天。实验动物随机分为正常组（32只），模型组（32只），黄芪建中汤低、中、高剂量组（各24只）。1.2 药物制备 中药均购自浙江中医药大学中医门诊部。大黄制剂：将生大黄饮片碎成粉，用蒸馏水浸泡，置于50水溶6h，去渣取汁；黄芪建中汤药物组成：黄芪9g，白芍18g，桂枝9g，炙甘草6g，生姜9g，大枣12g，饴糖30g。按国家标准进行炮制后，提取加工成水煎剂，低、中、高剂量浓度分别为含生药1.5kg/L、3kg/L、6kg/L。1.3 试剂及仪器 D木糖试剂盒，南京建成生物工程研究所；胃泌素放免试剂盒，北京北方生物技术研究所；兔抗大鼠胃泌素抗

5、体，北京北方生物技术研究所；酶标记HRP二抗，美国DAKO公司；二氨基联苯胺（DAB），北京中山生物技术公司；DK600S型三用恒温水浴箱；PYXDHS35×40隔水式电热恒温培养箱；SN695型智能放免测量仪；LX20型Beckman全自动生化分析仪；722型光栅分光光度计；1512型Leitz型组织切片机；OLYMPUS双目显微镜；LEICADMLB偏光摄像显微镜等。1.4 方法 模型组，黄芪建中汤低、中、高剂量组，以三因素复合法复制脾气虚证模型，具体方法如下：每日上午以3ml/只灌服大黄制剂液，日1次；每日下午将动物负重于大鼠尾根部缠绕重量为该大鼠体重10%的保险丝，放入水深5

6、0cm、水温20的水槽中游泳，以力竭为度大鼠鼻尖没入水面10秒，日1次。控制饮食，每日8：00am给食，8：00pm撤食。共21天。造模期间正常组每日上午以3ml/只灌服生理盐水，自由饮食。共21天。实验第22天，从正常组和模型组各随机取出8只大鼠，摘眼球取血，作相关处理后处死。其余大鼠继续实验：正常组、模型组给予生理盐水灌胃3ml/d，用药组分别给予黄芪建中汤低、中、高剂量3ml/d灌胃，共21天。分别于干预后第7、14、21天每组各取大鼠8只，分3次处理。            &

7、#160;                1.5 症状、体征观察 实验全程观测动物的体重，食量，粪便（腹泻、肛门污秽、拉尾排便），毛色，拱背，嗜睡倦怠，扎堆，乏力等情况。比较各组之间症状与体征的区别。1.6 指标检测 全部大鼠眼球取血，分离血清，检测血清木糖浓度、血清肌酸磷酸激酶（CPK）活性、血清GAS。动物解剖后，取胃窦部组织，以EnVision二步法检测胃窦G细胞。G细胞计数：光镜下G细胞显棕黄色，呈带状分布于黏膜中下带，胞浆内有

8、深浅不同的棕黄色或棕褐色颗粒。光镜高倍视野（×400）对每张切片取胃窦部5个视野，读G阳性细胞数，并换算出每mm2面积内G细胞数。1.7 统计学方法 采用统计软件SPSS11.0处理数据，数值用“均数±标准差（x±s）”。2 结果2.1 脾气虚证造模情况 造模大鼠于第2、3天开始泄泻，多为便溏；第6、7天，出现食量减少；10天以后，出现成群蜷缩，扎堆，拱背，精神倦怠，嗜卧，四肢无力，反应迟钝，拉尾排便次数增多，同时毛发枯槁，甚至稀少；到18、19天，多数动物肛门脱垂，明显消瘦；正常组大鼠饮食、活动、大便性状及毛发等均无异常，体重逐渐增加。动物解剖后，造模组大鼠胃黏

9、膜颜色变浅，表面黏液少，可见黏膜水肿或糜烂，点状出血，个别出现大小不一的溃疡面；正常组大鼠胃黏膜表面平整光滑，呈粉红色，有光泽，被覆较多黏液，黏膜皱襞规整，胃壁弹性良好。HE染色，经光镜观察，造模组大鼠胃黏膜薄、黏膜表面轻度糜烂，上皮坏死、脱落而不完整，固有层及黏膜下层炎细胞浸润，红细胞数量明显增加，血管扩张充血；正常组胃黏膜结构清楚，上皮完整，可见绒毛和皱襞，炎细胞浸润较少，腺体完整且排列整齐。指标检测显示：模型组大鼠的血清木糖浓度、CPK活性、血清GAS及胃窦黏膜G细胞数下降，与正常组比较，差异有显著性（P0.01）。结果见表1，表明脾气虚证模型成立。表1 三因素复合法对大鼠的影响（略）2

10、.2 黄芪建中汤对血清木糖浓度、CPK活性影响的剂量与时间效应 见表2。黄芪建中汤各剂量组血清木糖浓度、CPK活性随着用药时间的延长呈递增的趋势。其中，高剂量组用药14天时，血清木糖浓度与同期模型组比较，差异有显著性（P0.5）；中、高剂量组用药21天时，血清木糖浓度、CPK活性与同期模型组比较，差异均有显著性（P0.5或P0.1）。表2 各组大鼠血清木糖浓度、CPK活性比较（略）2.3 黄芪建中汤对血清GAS影响的剂量与时间效应 见表3。黄芪建中汤各剂量组血清GAS随着用药时间的延长呈递增的趋势。其中，高剂量组用药14天时，与同期模型组比较，差异有显著性（P0.5）；而中、高剂量组在用药21

11、天时，与同期模型组比较，差异均有显著性（P0.1）。表3 各组大鼠血清GAS、G细胞数比较（略）2.4 G细胞的分布、形态结构特点 免疫组化染色G细胞为深棕色，主要分布于胃窦黏膜腺体的中下1/3，或散布于黏膜上皮细胞之间，细胞分布不均匀，常单个或几个夹在腺细胞之间，对照片为阴性。细胞形态各异，呈圆形、柱状、棱形或不规则，有的连续在一起形成团状。胞质内分泌免疫反应颗粒粗大，着色较深，为或棕黄色或淡棕色或棕褐色颗粒，有的细胞有突起，伸入到其它腺细胞之间，或基膜之间，或到腺腔。造模大鼠胃黏膜组织受损，胃窦G细胞胞浆内分泌免疫反应颗粒细小，着色变浅，数量减少，甚至缺如。2.5 黄芪建中汤对胃窦黏膜G细

12、胞数影响的剂量与时间效应 黄芪建中汤各剂量组胃窦黏膜G细胞数随着用药时间的延长呈递增的趋势。其中，中、高剂量组用药21天时，与同期模型组比较，差异均有显著性（P0.5或P0.1）；且中剂量组与高剂量组相互比较，差异亦呈显著性（P0.05），以高剂量组为优。见表3。                             

13、;3 讨论3.1 脾气虚证造模方法 复杂的病因是中医临床症候的一大特点，本研究采用大黄法、游泳力竭法和饥饿法复合，模拟中医传统病因来复制脾气虚证模型，是在中医理论的指导下从本质上对证候进行复制，并充分体现了中医致病因素的多重性。造模后，大鼠相继出现消瘦、大便溏泄、倦怠乏力、毛发不荣等脾气虚证的症状与体征；同时，造模大鼠血清木糖浓度、CPK等较为公认的客观指标均有明显改变。在造模因素撤去后，模型大鼠以上症状、体征仍存在，各项指标未见明显改善，而用药组则得到了不同程度的恢复。说明多因素复合复制的脾气虚证大鼠模型稳定性良好，克服了单因素造模方法持续时间短、自愈性强的缺点。该方法在思路和方法上符合中医

14、基本理论，复制的动物模型出现相应证的证候，并经得起药物反证，符合脾虚动物模型造型的基本要求，是切实可行、稳定的脾气虚证造模方法。3.2 脾气虚模型GAS、G细胞的变化 本研究建立的脾气虚证大鼠模型胃黏膜组织受损，胃窦黏膜G细胞数量减少，甚至缺如，着色变浅，说明该造模方法复制的脾气虚大鼠的胃肠黏膜组织已发生器质性改变。由于G细胞数量降低、细胞内含有的胃泌素分泌颗粒减少，导致GAS分泌量下降，从而使血清GAS水平下降。另外，由于GAS的分泌还受胃肠内容物刺激的影响，脾气虚弱，消化吸收功能障碍，食欲减退，胃内容物减少，经过消化的蛋白质分解产物也相应减少，这样亦会使GAS的分泌量降低，从而影响胃酸和蛋白酶的分泌，反过来进一步加重消化机能障碍，构成逐渐加重的恶性循环。可以推论：脾气虚证胃窦黏膜G细胞数量减少，胞浆内分泌免疫反应颗粒细小，着色变浅，释放GAS减少，血清GAS水平降低。3.3 黄芪建中汤对脾气虚大鼠的干预作用 黄芪建中汤对脾气虚证大鼠有可靠的治疗作用。随着用药时间的延长，各剂量组的相关指标逐渐改善。用药14天时：高剂量组由于浓度高，在体内达到有效血药浓度的时间相对较快，使部分指标血清木糖浓度和血清GAS已经得到恢复；用药21天时：由于用药时间长，药物在体内达到了稳定且有效的血药浓度，中、高剂量组的各项指标均回升；另外，值得一提的是，