梗阻性黄疸大鼠中性粒细胞凋亡的实验研究

1、梗阻性黄疸大鼠中性粒细胞凋亡的实验研究         09-08-02 16:42:00     编辑：studa20                     作者：高海斌 陈斌 倪勇 邓雪松 王成友 张敏杰【摘要】  目的：探讨梗阻性黄疸大鼠外周血中性粒细胞凋亡的改

2、变。方法：将 66 只成年 Wistar 大鼠随机分为正常（A） 组、假手术（B）组和胆总管结扎（CBDL, C）组，B、C 组术后又分为 1、3、7、10、14 d 5 个时相点；应用流式细胞仪检测中性粒细胞（PMN）的凋亡指数（AI），通过 ELISA 双抗体夹心法测定血清 IL-8。结果：C 组大鼠术后各时相点 PMN的 AI 显著降低，与 A 组和 B 组均有显著差异（P < 0.05）；C 组大鼠术后各时相点血清 IL-8 水平显著升高，与 A 组和 B 组均有显著差异（P < 0.05）；且血清 IL-8 水平与 PMN 的 AI 的改变有显著负相关性。结论：梗阻性黄疸

3、大鼠外周血 PMN 的 AI 明显降低，且与 IL-8 水平异常升高有关，在梗阻性黄疸过度炎症反应的发生、发展中有着重要意义。 【关键词】  胆道梗阻；中性粒细胞；凋亡；细胞因子；IL-8    AbstractObjective     To  investigate  the  changes  of  apoptosis  of  peripheral  polymorphonuclear  neutrophil(PMN

4、)  in  the  rats  with  obstructive  jaundice.    Methods     66  Wistar  adult  rats  were  randomly  divided  into  three groups:  normal  group  (group  A),  sham 

5、; operation  group  (group  B)  and  common  bile  duct  ligation  group  (CBDL,  group  C),  and  each  group  were  randomly  divided  to  subgroups  of  day  1,  3,  7,

6、0; 10,  14  again.  The  flow  cytometry  was  used  to  detect  and  evaluate  the  change  of  apoptosis  in  vitro  after  PMN  were  harvested from  the  rats.  IL-8  was&

7、#160; detected  by  ELISA  method.    Results     Apoptosis  index  (AI)  of  PMN  in  group  C  was  lower  than  in  groups  A  and  B  at  1,  3,  7,

8、60; 10,  14  days  after  CBDL;  The  level  of  IL-8  in  serum  in  group C  was  higher  than  in  groups  A  and  B  at  1,  3,  7,  10,  14  days  after

9、60; CBDL.  Moreover,  there  was  a  marked  negative correlation  between  AI  and  level  of  IL-8.    Conclusion     The  apoptotic  PMN  is  decreased,  which  is  in

10、timately associated  with  the  level  of  IL-8,  which  may  induce  excessive  inflammation,  and  play  a  crucial  role  in  the  initiation and  development  of  obstructive  jaundice.&

11、#160;   Key  Words    Obstructive  jaundice;  Polymorphonuclear  neutrophil;  Apoptosis;  Cytokine;  IL-8    中性粒细胞（Polymorphonuclear neutrophil, PMN）是机体非特异防御反应的重要执行者，在炎症反应中扮演重要角色，在有效地发挥防御功能，避免炎症的加强、扩散和迁移的方面具有重要作用1。我们之前的研究表明，梗

12、阻性黄疸大鼠腹腔巨噬细胞吞噬能力异常，不能及时清除凋亡的 PMN，导致机体免疫功能障碍2，但有关 PMN 凋亡功能改变的研究却鲜有报道。为此，在此基础上，我们应用流式细胞术检测大鼠梗阻性黄疸后外周血 PMN 凋亡的改变并试探讨其意义及发生机制。    1    材料与方法    1.1    实验动物分组及模型制备    健康成年 Wistar 大鼠 66 只（第一军医大学动物中心），雌雄各半，体重 220280 g，随机分为 3 组：正常对照（

13、A）组（n = 6），定为 0 时相；假手术对照（B）组（n = 30），分术后 1、3、7、10、14 d 5 个时相点，每个时相点 6 只；胆总管结扎（C）组（CBDL，n = 30），分为术后 1、3、7、10、14 d 5 个时相点，每个时相点 6 只。    CBDL 模型制备：乙醚吸入麻醉，上腹正中切口进腹，近十二指肠双重结扎胆总管，并于两结扎线之间切断。B 组除不结扎和切断胆总管外，其余同上；A 组不作任何处理。术后实验大鼠自由饮水进食，于术后相应时相点处死。    1.2    主要试剂与

14、仪器    流式细胞仪（Beckman Coulter 公司 XL 型），Annexin-V-FITC 试剂盒购于 Bender 公司，RPMI 1640 培养基购于 Gibco 生物技术公司，中性粒细胞分离液购于上海华精生物科技有限公司。    1.3    中性粒细胞的分离与纯化    取肝素抗凝静脉血样，于室温下静置 1 h 或离心 2 000 r/min、15 min，然后吸取富含白细胞的“白膜层”。然后应用 Ficoll （聚蔗糖）- Hypaque（泛影葡胺）密度

15、梯度离心法3 行中性粒细胞的分离与纯化，最后台盼蓝染色法检查 PMN 活力 > 98%，瑞氏染色法检查 PMN 纯度 > 95%。    1.4    PMN 凋亡指数检测    取纯化 PMN，调整细胞浓度为 1×106/mL，加入 5   L Annexin-V 和 10   L 碘化丙锭（PI），室温避光 15 min。然后加入0.4 mL 1×Binding 缓冲液上流式细胞仪检测。采用Annexin-V 和 PI 双标法，双

16、通道检测 5 000 个细胞，激发光波长 488 nm，发射光波长 515、560 nm。Annexin-V + / PI - 的为凋亡细胞，Annexin-V + / PI + 的为坏死细胞，Annexin2V - / PI - 的为活细胞，计数凋亡细胞占的百分比作为凋亡指数。    1.5    血清 IL-8 检测    严格按试剂盒说明书要求操作，根据标准品得出的 A（OD）值绘制标准曲线，计算出样本中 IL-8 的浓度。    1.6  

17、0; 统计学方法    实验结果以 x±s 表达，采用方差分析；t 检验；直线相关分析。    2    结    果    2.1    外周血 WBC 及 PMN 的数量变化    随着胆道梗阻时间的延长，C 组外周血 WBC 数目不断增加，且以 PMN 升高为主，呈明显的时间依赖性改变。B 组 WBC 和 PMN 在术后变化不大。C 组各时相点 WBC 和 PMN 均明显

18、高于 A 组及 B 组相应时相点。    2.2    外周血 PMN 的凋亡指数和血清 IL-8 水平    见表 1 和表 2。C 组中各时相的凋亡指数与 B 组同一时相点和 A 组相比较差异均有统计学意义（均为 P < 0.05）。C 组血清 IL-8 各时相水平与 B 组同一时相点和 A 组相比较差异均有统计学意义（P < 0.05）。    2.3    相关性分析    通过对 C 组血清 I

19、L-8 水平与 PMN 的凋亡指数进行相关分析（r = -0.909，P < 0.0001），表明 IL-8 水平与凋亡率存在显著负相关性。     09-08-02 16:42:00     编辑：studa20    3    讨    论    PMN 作为机体非特异防御反应的重要执行者，它以凋亡的方式死亡，并被巨噬细胞识别、吞噬而清除，对维持内环境的稳定和促使已发生炎症的局限及消退具

20、有重要意义1。因此，凋亡被认为是机体清除具有潜在损害活性的 PMN 有效的生理调节机制。当 PMN 凋亡减少或延迟，大量滞留于机体组织，过度、持续地活化并产生大量的活性氧自由基和多种蛋白水解酶，加重炎症反应和组织损伤，甚至引发全身炎症反应综合征和多器官功能障碍综合征4，5。    梗阻性黄疸后围手术期易并发感染和败血症与机体免疫功能的紊乱，与炎性细胞机能的改变有明显的关系2。本实验结果显示，随着胆道梗阻的形成和时间的延长，BDL 大鼠外周血的 WBC 数量不断上升，尤其以 PMN 升高为主，呈现时间依赖性变化。并且，CBDL 大鼠术后 1 d PMN 开始凋亡，且

21、随着病程的延长逐渐降低。这说明 CBDL 大鼠的 PMN 不仅存在数量增加，而且凋亡贯穿于梗阻性黄疸的始终，这必将在梗阻性黄疸感染和脓毒血症的发生、发展中起着十分重要的作用。    IL-8 是机体内一种重要的细胞因子，其主要靶细胞是 PMN，对 PMN 起特异性的趋化和活化作用，并可诱导它进入炎症部位，促进变形、脱颗粒、释放溶酶体酶、产生超氧化物，并延长存活时间和增强活性功能6。本实验结果显示，CBDL 大鼠术后血清 IL-8 水平逐渐升高，且与 PMN 的凋亡指数的变化呈现负相关。我们认为，IL-8 异常升高可能是引起 PMN 凋亡延迟的原因之一，导致持续、过

22、度的炎症反应和组织损伤。而 IL-8 参与细胞凋亡调节的具体机制目前尚未明确。    总之，CBDL 大鼠存在 PMN 凋亡的延迟，与细胞因子 IL-8 水平的升高密切相关。深入了解外周血 PMN 凋亡变化的意义，有利于揭示梗阻性黄疸易发感染和脓毒血症的机理，为临床治疗提供可靠的理论依据。【参考文献】  1Chilvers ER, Cadwallader KA, Reed RJ, et al. The function and fate of neutrophils at the inflamed site: prospects for therapeutics interventionJ. JR Coll Physicians Lond, 2000, 34(1)