Toll样受体基因多态性和儿童特应性疾病的相关性研究

1、Toll样受体基因多态性和儿童特应性疾病的相关性研究一、 项目研究意义特应征（atopy）又称异位性，是上世纪初叶Coca和Cooke命名的。特应征的定义各种各样，目前认为它是一种IgE介导的异常的特异性免疫反应。特应性疾病（atopic diseases）是指由上述反应引起的各种慢性皮肤和呼吸道疾病，包括特应性皮炎、变应性鼻炎和变应性哮喘等，它们共同的特点是皮肤过敏原试验阳性，血清总IgE和特异性IgE升高。近年的流行病学研究结果显示特应性疾病的发生率在上升，尤其在儿童或青少年中更为明显。以哮喘为例，我国大约有1000万儿童哮喘患者。全国儿科哮喘防治协作组于2000年进行了第二次全国城市儿童

2、哮喘患病率抽样调查显示，全国儿童哮喘患病率为1.97，比1990年第一次哮喘流调时增加了近1倍。1990年我省的儿童哮喘现患率为6%，累计发病率为1.16%，而2000我省的儿童哮喘现患率为1.44%，累计患病率为2.14%，无论是现患率还是累计患病率均较10年前有大幅上升。特应性疾病发病率的上升给家庭和社会带来沉重的负担，仍以哮喘为例，哮喘患儿中，有5.64的学龄儿童不能上体育课，1年内因病假缺勤的占了42.47。有95.47的患儿家长因为孩子患哮喘使工作受到影响，其中每年耽误10天以上的占到62.27。因此，特应性疾病不仅是21世纪亟待攻克的医学问题，也已成为亟需解决的社会问题。特应性疾病

3、有强烈的家族倾向，一组对大学生的调查发现：当一级亲属中没有一个患特应性疾病时，特应性疾病的患病率为15%；当其中一个一级亲属具特应征，特应性疾病的患病率为33%，如两个或以上一级亲属具特应征，则其患病率为68%。另一组调查发现，父母均无特应性疾病，小儿特应性疾病的患病率为10%，父母之一具特应征，小儿特应性疾病的患病率为40%，如果父母双方均具特应性，则小儿特应性疾病患病率为60%-80%，可见特应性疾病受遗传的强烈影响。随着人类基因组计划的开展，已有越来越多的学者关注特应性疾病和基因的关系。近10年来的研究发现，特应性疾病是个多基因遗传病，已经发现多个和特应征相关的基因位点，不同人种存在种族

4、差异性。根据研究结果筛选出特应征基因携带者，有助于特应征的早期诊断和干预，减少特应性疾病的发生。特应性疾病的发生是多种危险因子相互作用的结果，包括遗传易感性、暴露于变应原的时间和数量以及非特异性的“佐剂”因子如空气污染等。过去10年中，一些社会经济状况良好的国家哮喘和过敏性疾病的发病增加，难以完全用遗传背景的改变解释。令人感兴趣的是在欧洲和北美有许多关于农村儿童和成人特应性疾病发病率低的报道。因为在农村的动物上检测到大量的微生物，因此人们认为早期暴露于微生物的产物可使个体调节免疫反应，使Th2向Th1转变，从而减少特应性疾病的发生，相反儿童在免疫成熟期处于“清洁”的环境会导致Th2表达增加，增

5、加特应性疾病的机会，这就是卫生学说（hygiene hypothesis）的由来。尽管有这样的发现，但是其机制尚不清楚。内毒素和LPS是G-杆菌细胞的外层成分。模式识别受体（pattern recognition receptor，PRR）识别内毒素，通过内毒素受体复合体（包括LBP、CD14、MD2、TLR）激活固有免疫系统。固有免疫反应是抵御感染的一道强有力的早期屏障，在感染的最初几小时内，它可以识别不同种类的病原细菌、病毒和真菌，并且对于激发晚一步启动的获得性免疫反应也至关重要。而Toll样受体（Toll-like receptors,TLRs）家族是触发固有免疫反应的关键所在，因此人们

6、对Toll样受体的研究成为固有免疫研究的热点之一。TLRs在抗原递呈细胞、调节性T细胞和其他细胞表面表达在环境和免疫系统的相互作用中起关键作用，这些细胞分泌的信号调节CD4+、CD8+细胞的成熟，这种成熟决定了对环境变应原的获得性免疫反应。因此认为TLR的基因变异会对免疫反应类型产生影响，也会影响特应性疾病的发生。Toll样受体家族到目前为止共发现10类受体。现被命名为TLR4的第一个哺乳动物TLR于1997年由耶鲁大学的Janeway和Medzhitov发现，TLR4被G-细菌细胞壁的一种成分脂多糖（LPS）激活，还可识别其他细菌的PAMPs，同时又能介导呼吸道合胞病毒（RSV）的固有免疫。

7、目前研究标明TLR4基因在9q32-33,SNP分析发现896A/G导致Asp299/Gly，通过减少气道上皮TLR4密度、减少炎症细胞因子的分泌使机体对内毒素的反应性下降，从而增加特应性疾病的发生。英国报道TLR4基因多态性与哮喘的发生无关，却影响特应征的严重程度。也有研究发现在高度暴露于内毒素的儿童中TLR4/+4434和常见过敏原特异性IgE的关系，但尽管TLR4/+4434多态性和特异性IgE高度相关，但未发现其和哮喘和枯草热之间明确的关系，因此可能有其他分子参与其中如MD2、CD14等。CD14是介导内毒素细胞反应的主要受体，是特应性疾病的另一个候选基因，位于5q，已经发现CD14基

8、因多态性与IgE高水平密切相关。婴幼儿期感染释放内毒素结合CD14受体，刺激Th1细胞因子表达，若存在CD14多态性，可使Th2表型持续表达。TLR2由阿拉伯甘露聚糖脂激活，这种糖脂是包括结核在内的分支杆菌的细胞壁成分，也可由钩端螺旋体属细菌的LPS激活，其信号传导途径和TLR4相似。Eder W等研究发现TLR2/-16934的变异决定了农村儿童哮喘和特应征的易感性，并认为TLR2是欧洲农村儿童哮喘发病的主要候选基因。含有T等位基因能够增加抗原递呈细胞表面的TLR2表达减少哮喘和过敏性疾病的发生，反过来也增加表达于微生物产物的TLR2配体的保护作用。Hertz等发现细菌脂肽可通过TLR2诱导

9、树突状细胞的成熟，使T细胞增值和IFN分泌能力大大提高，而TLR2的基因变异则会削弱这种功能，增加特应性疾病的发生。TLR3基因位于4q35，能识别双链病毒RNAs，有报道其和日本人群过敏性哮喘的发生有关联。TLR9则能识别主要存在与细菌DNA中的特殊序列CpG重复序列，而后者可刺激获得免疫系统调节Th1/Th2平衡，减少特应性疾病的发生，Lazarus等报道TLR91237C/T多态性与欧洲美裔的哮喘发病有关。因此，研究Toll样受体基因多态性和我省儿童特应性疾病的相关性，阐明Toll样受体在我省儿童特应性疾病发病中的作用，对于我省儿童特应性疾病的防治，增进儿童健康具有十分重要的意义，也有利

10、于我省“和谐社会”的构建。二、 项目研究目标及与申请者研究工作长期目标的关系 本项目是利用基因测序的方法，系统研究Toll样受体家族的基因多态性，探讨TLR4、TLR2、TLR3、TLR9、CD14基因多态性和我省儿童特应性疾病之间的关系，寻找特应性疾病的候选基因，利于早期诊断和干预特应性疾病。 申请者所在的学科一直从事儿童哮喘和变态反应性疾病的基础和临床研究。申请者的主要研究方向在儿童喘息性疾病和特应征的关系及其早期诊断和干预，目前已完成“特应征和呼吸道合胞病毒毛细支气管炎的关系”课题，发表数篇论文在各级杂志上，承担的省教育厅课题“呼吸道合胞病毒毛细支气管炎气道炎症和预后的关系研究”也已取得

11、初步成果。 本项目小组长期工作目标是建立儿童特应性疾病的基因诊断方法，寻找判断儿童特应性疾病预后的指标，从而减少特应性疾病的发生、改善预后。特应性疾病的基因研究是全球变态反应学界的研究热点，但目前有关中国儿童的资料很少。我国变态反应专业仍在发展中，很多医院尚未设立变态反应科，过敏性鼻炎、过敏性哮喘和皮炎分别由耳鼻喉科、呼吸科和皮肤科医生诊治和管理。因此申请者在这方面的研究，有利于我省在变态反应学术方向的发展。三、 项目研究内容，研究方案和进度安排（一） 研究内容1、利用DNA测序法测定特应性疾病儿童和正常对照儿童TLR2、TLR3、TLR4、TLR9、CD14等相关位点及其附近的核苷酸序列。

12、2、利用相关研究法观察儿童特应性疾病与TLR2、TLR3、TLR4、TLR9、CD14相关位点多态性的关系。3、比较不同特应性疾病相关位点核苷酸序列的差异。 4、发现中国特应性疾病儿童特有的疾病相关多态位点。（二）研究方案和方法1、病例入选符合下列标准： 1）年龄012岁；2）临床诊断为哮喘、过敏性鼻炎或特应性皮炎；3）血清总IgE升高；4）皮肤过敏原试验阳性或血清特异性IgE升高。分别记录年龄、性别、诊断、发病时间、家族特应征史。其中哮喘组100例，过敏性鼻炎100例，特应性皮炎50例。选取012岁正常体检儿童100例为对照组，均不符合上述24项入选标准。 2、血清总IgE和特异性IgE测定

13、采用瑞典法码西亚公司UniCAP系统，皮肤过敏原皮试采用德国阿罗格公司标准变应原。 3、样品采集和模板提取：采血2ml，酚氯仿抽取法提取血液白细胞总DNA ，700冰箱冻存。 4、PCR反应：从Genbank下载基因组序列，参考文献并用Primer3软件设计引物，按有关方法进行PCR反应。序列比对采用Blast软件。引物由华大基因上海鼎安生物公司合成。 5、用WizardR PCR Preps DNA纯化试剂盒纯化PCR产物。6、测序和分析：利用ABI PRISM377平板凝胶测序仪，采用PCR双脱氧法测序，用有关程序进行核酸序列多态性分析。测序在杭州华大基因研发中心进行 。7、统计方法：用2

14、检验分析两组等位基因和基因型频率以及Hardy-Weinberg吻合度，不同基因型总IgE浓度用方差分析，比较双侧进行。（三）技术路线012岁儿童，收集临床资料，测定SPT、血TIgE、SIgE ,收集标本特应性疾病组正常对照组特应性皮炎过敏性哮喘组过敏性鼻炎提取白细胞DNAPCR扩增及纯化DNA序列测定及分析TLR3TLR2TLR9CD14TLR4统计分析、撰写论文（四）关键技术1、确保样本的代表性，入选病例必须符合本研究的要求。2、设计多态位点PCR反应的特异性引物，使PCR反应产物尽可能长一些，以获取更多的序列信息，提高测序效益。（五）进度安排2006年1月2006年12月 收集样本、提

15、取DNA、设计引物2007年1月2007年6月 PCR扩增、测序、分析2007年7月2007年12月 资料总结、论文撰写、成果鉴定四、 项目创新之处 由于地域、种族、国度的不同，不同的人群中基因多态性的研究会有不同的结果，而目前国内没有有关Toll样受体基因多态性和我国儿童特应性疾病关系的研究，因此本研究对于了解我国儿童ToLL样受体基因多态性有十分重要的意义。其创新点在于：（1）首次研究中国儿童ToLL样受体基因多态性和儿童特应性疾病的相关性。（2）利用基因测序的方法研究多态性，可能发现新的多态位点。（3）比较不同特应性疾病基因多态位点的区别，可以分析不同疾病的发病机制。五、 工作基础与工作

16、条件申请者所在学科是国家首批拥有硕士学位授予单位。1997年被列入浙江省医学重点学科建设，2000年经省卫生厅验收合格授牌并被评为优秀省医学重点学科。学科20多年来致力于小儿呼吸疾病的基础及临床研究，成果丰硕，特别在小儿毛细支气管炎的发病机理及其与哮喘的关系领域，达到国内领先水平，在国内享有较高声誉。本学科主攻方向是儿童哮喘和变态反应性疾病的基础和临床研究。学科拥有专科病房40余张，病房年住院人次达1000人次以上，年门诊病人1.5万，有足够的病例保证。项目小组是一个临床实践和基础研究相结合的工作小组，目前正承担国家和省自然科学基金研究。项目负责人目前正主持厅局级课题2项，项目主要成员曾经参加

17、国家重大课题“人类基因组计划1项目”和“水稻基因组计划”，并完成中科院重大课题“腾冲嗜热厌氧菌全基因组序列分析”，把基因组学和生物信息学两个学科结合起来，为国家首次获得了一张原核生物全基因组序列图谱，填补了我国在此研究领域的空白，该研究成果对我国生命科学研究的发展具有重要的意义，达到世界先进水平。目前已收集符合本研究标准的病例标本150例，完成TLR4和CD14的引物设计和PCR扩增，确定了DNA提取方法和PCR扩增条件。正在进行TLR2、TLR3、TLR9的序列比对和引物设计。学科有专用实验室200m2，具备分子生物学实验条件，拥有PCR扩增仪、紫外分光光度计、生物图像分析仪、超低温冰箱、超

18、低温离心机、特异性变应原测定UniCAP系统等设备。基因测序由杭州华大基因研发中心承担。六、 预期研究结果及其利用研究结果的计划和今后发展的思路预期研究结果包括（1）Toll样受体基因多态性和儿童特应性疾病的发生有关。（2）不同特应性疾病可能有不同的多态位点。（3）研究结果将以论文发表，在国内核心期刊和国外杂志发表35篇，并以科研成果争取省级以上科学技术奖。 将利用研究结果（1） 利用研究成果设计PCR试验，检测Toll样受体多态位点。（2） 用于临床儿童特应性疾病的诊断和鉴别诊断。今后发展思路过度的Th2免疫应答是特应性疾病的主要发病机理，调控Th1/Th2间的平衡是治疗特应性疾病的有效途径

19、。有学者提出，前生命期处理诱导Th1免疫应答可以减少哮喘的发生。研究显示，TLR9在CpG刺激后可抑制Th2免疫应答并促使向Th1转变。CpG及其诱导产生的IL-10调节Th1/Th2平衡被认为是特应性疾病的特效治疗方案。由于免疫应答向Th1转变也可增加气道的炎症反应，故在早期天然免疫中产生抗炎反应是预防特应性疾病的有效方法。 此外，早期接触感染原也会通过TLR4、TLR2调节Th1/Th2平衡从而减少特应性疾病发生。本研究将提供各类特应性疾病的TLRs基因型，在本研究基础上将继续开展特应性疾病发病机理和早期干预措施的研究，在特应性疾病中将有广阔的应用前景。七、 主要参考文献1、Noguchi

20、 E,Nishimura F,Fukai H,et al.An association study of asthma and total serum immunoglobin E levels for Toll-like receptor polymorphisms in Japanese population.Clin Exp Allergy 2004;34:177-1832、Lazarus R,Klimecki WT,Raby BA,et al.Single-nucleotide polymorphisms in the Toll-like receptor 9gene:frequenc

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