微生物发酵生产二羟基丙酮的应用研究进展

1、微生物发酵生产二羟基丙酮的应用研究进展李尧(西南石油大学,成都610500摘要:二羟基丙酮及其衍生物作为一种重要的化工、生化原料,在精细化工、制药、食品、化妆品工业和水质净化等方面潜在广泛的应用前景。本文介绍了近年来发酵法生产二羟基丙酮及其应用研究的进展,并对二羟基丙酮的应用前景进行了展望.文献标识码:A文章编号:1671-6892(200705-0020-0004Review of the Production of Dihydroxy Acetone throughMicrobial FermentationLI Yao(Southwest Petroleum University,Che

2、ngdu 610500Abstract:Dihydroxy acetone and its derivatives are important chemical or biochemical materials,which have been widely applied in chemistry,pharmacy,food,cosmetic industry and purification of water.Dihydroxy acetone produced by fermentation methods were introduced in this paper.Key words:m

3、icrobial fermentation ;dihydroxy acetone(DHA收稿日期:2007-08-31四川食品与发酵Sich u a n Food a n d Fe r m e n t a t ion二羟基丙酮(dihydroxyacetone ,DHA是一种水溶性的最简单酮糖,其衍生物是有机化学合成中非常重要的一类中间体。由于二羟基丙酮及其衍生物作为一种重要的化工、生化原料,在精细化工、制药、食品、化妆品工业和水质净化等方面潜在广泛的应用前景,因此受到国内外研究者广泛重视。本文就国内外DHA 生产应用研究进展作一介绍,为DHA 生产和应用研究者提供一定的参考。1二羟基丙酮生产

4、方法DHA 的生产方法主要有化学合成和微生物发酵两种方法。最常见的二羟基丙酮化学合成方法主要有一溴丙酮酯化醇解法和1,2-丙二醇的氧气或K 2Cr 2O 7/H 2SO 4氧化法两种。前者反应条件温和、合成用生产设备要求低且简单、产品收率高、产品纯度高,但主原料一溴丙酮的价格导致生产成本过高是该方法的最大缺点;后者与前者刚好相反,反应条件及设备要求高、需要用昂贵的金属催化剂、产品收率不高,但原料成本低并可连续化或半连续化生产。第43卷(总第139期李尧微生物发酵生产二羟的丙酮其应用研究进展与化学合成法相比,微生物发酵生产DHA具有专一性强、反应条件温和、底物利用率高、生产工艺相对简单、副产物少

5、,同时微生物发酵制备的DHA可应用于食品和医药工业领域等优点,成为人们研究的重点。微生物转化甘油生产DHA的机理就是利用微生物代谢产生的甘油脱氢酶,使甘油分子结构中2位C上的羟基进行脱氢反应,生成DHA。因此凡是能够利用甘油,并且具有相应的甘油脱氢酶系的微生物,都可以转化甘油生产DHA。但是具有生物转化DHA工业价值的微生物主要是醋酸杆菌、葡萄糖酸杆菌、酵母和脉孢菌等,其中醋酸杆菌属的氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans是工业发酵生产DHA的重要菌种1。氧化葡萄糖酸杆菌是一种专性好氧的G-菌,属于醋酸杆菌科(Acetobacteraceae。在麦芽汁琼脂和酵母膏葡萄糖琼

6、脂平板上的菌落呈圆形,乳白到微黄色,有时中央变褐或周围带黄色。在酵母膏葡萄糖酸琼脂上生长良好,形成或不形成5-酮基葡萄糖钙结晶。在含酵母膏、乙醇、CaCO3琼脂上生长良好,并产生乙酸,溶解CaCO3,平板上呈透明圆圈。其生长最适温度2530,最适pH5.56.0。氧化葡萄糖酸杆菌含有多种酶类,有些酶可以催化氧化一系列底物。Asakura2等研究发现,G.oxydans 中的葡萄糖脱氢酶、葡萄糖酮酸脱氢酶和醛糖脱氢酶都能够作用于多种化合物,而且G.oxydans中几乎所有的葡萄糖脱氢酶活性及一半的葡萄糖酮酸脱氢酶活性来源于L-山梨糖/L-山梨酮脱氢酶。同时大多数的此类酶位于细胞膜上,只有少数在细

7、胞浆中,在催化底物反应过程中无需底物和产物的透膜运输,大大提高了其应用价值,因此,氧化葡萄糖酸杆菌广泛应用于二羟基丙酮、维生素C、D-葡糖酸等工业化生产,具有非常高的工业价值。1.2.3发酵法生产二羟基丙酮的碳源、氮源Gluconobacter oxydans转化甘油生成DHA分初级、次级两个发酵阶段。初级发酵阶段以培养足量的菌体,用于次级发酵转化甘油生成DHA为目的。Gluconobacter oxydans能利用单糖或者糊精作为碳源,尤其是山梨醇,甘露糖醇,果糖和葡萄糖,其中山梨醇发酵效果最好。在菌体生长阶段的初级发酵阶段,要尽量避免甘油作为一个能量来源和碳源,防止二羟基丙酮的形成。因为二

8、羟基丙酮产物的存在会抑制菌体的生长,影响次级发酵甘油转化生产DHA。初级培养阶段最好氮源是酵母膏,当然其它已知氮源,如氨基酸、玉米浆等也可以作为氮源,用于发酵生产DHA。大量实验结果显示酵母膏的最适含量在3g/l6g/l之间。在微生物的转化甘油合成DHA的整个过程中,发酵液中甘油和DHA的含量对发酵产量起着决定性的作用。在生产过程中,如果甘油初始量越高,早期积累的二羟基丙酮越高,则菌体繁殖会受到不可逆转的抑制,经过大约20h-30h之后,菌体生长的能力就会减弱,甚至停止生长,菌体转化甘油生成DHA能力随之减弱或停止。所以甘油的初始量一般不能过高。发酵液中转化甘油的含量一般为5%20%。Gluc

9、onobacter oxydans转化甘油生产DHA的pH适宜范围大约在3.84.8之间,而最适pH为4.04.5。pH的调节通常是在发酵培养基中添加钙氧化物来解决,而且低浓度钙离子的存在,促进甘油脱氢酶转化甘油生产DHA。钙离子的浓度在1g/ l5g/l之间较好。发酵温度在2834范围内,最适发酵温度3032。近年来,国内研究者对发酵法生产DHA的工艺进行了一些有意的探索。冯屏3等在间歇培养基础上,利用膜生物反应系统进行连续发酵制取二羟基丙酮。考查了不同甘油浓度、培养基组分和流速对于连续发酵中菌体生长特性和二羟基丙酮产率的影响。结果表明:甘油浓度为60g/l、玉米浆和蛋白水解液浓度为0.5g

10、/l、稀释率为0.067h-1时,菌体积累、甘油转化率和体积产率均较高,最长连续发酵持续时间为400h。冯屏4等利用在非生长培养基中弱氧化醋酸杆菌(Acebobacter Suboaxydans静止细胞发酵甘油制备DHA。通过改变培养条件,研究了影响静止细胞氧化特性的因素。结果表明,处于非生长期的弱氧化醋酸杆菌表现出稳定的高氧化活性,DHA转化周期缩短,获得了较高产率。此外考察了弱氧化醋酸杆菌静止细胞在重复利用多批次发酵中的氧化稳定性,经重复利用9个批次后,菌体细胞仍保持较高的氧化212007年第5期四川食品与发酵活性。当甘油浓度为60g/l时,DHA总产量可达49.16g,甘油平均转化率为9

11、1%,体积产率为8.97g/ (L.h,较生长细胞培养提高1015倍。由于发酵终产物二羟基丙酮与反应物甘油在化学结构及物理性质上的相似性,使得从发酵液中分离纯化DHA比较困难,目前国内外报道有关DHA发酵产物提取方法有直接浓缩结晶,溶剂萃取和膜分离等方法。美国专利(专利号5,770,41采用直接浓缩结晶法,在2l发酵溶液中加入22g碳酸钡,搅拌15min后,添加助滤剂(如活性炭、阳离子树脂等除去菌体、色素和蛋白质等杂质,最后再通过强阳离子交换树脂收集洗脱液,在真空下直接浓缩结晶后得到176g DHA产物。但该方法要反复洗脱,生产周期较长。美国专利(专利号4,076,589介绍了通过溶剂萃取法分

12、离二羟基丙酮,在发酵液中加入阳离子酰胺,考虑到双羟基化合物可与醛类发生可逆缩醛反应而将羟基屏蔽,得到的化合物的亲水性大大降低,可使用普通物理萃取将缩醛反应的产物分离,再通过可逆水解得到富集和纯化后的双羟基化合物,最后通过膜分离反应器100减压分离,蒸干后得到二羟基丙酮结晶。冯屏3等利用膜生物反应器(MBR连续发酵制取二羟基丙酮,通过膜的选择性滤过作用,即时引出产物,使菌体和产物DHA随时实现分离,避免了产物DHA在菌体细胞周围的高浓度积累,消除了产物对菌体的抑制。可使生物转化的平衡反应向所需方向移动从而获得较高的催化稳定性,得到不含细胞的澄清透过液,使反应和分离同时进行,大大简化了后续分离纯化

13、过程。2二羟基丙酮应用二羟基丙酮是一种天然存在的酮糖,具有生物可降解性,可食用且对人体和环境无毒害;其化学性质活泼,是一个重要的化学合成中间体,也是一种具有多种功能的添加剂,广泛用于食品、医药、化妆品和化学合成工业。二羟基丙酮最大特点之一就是具有极强的防晒性,利用这一特性,国外已成功开发了各种保护皮肤效果极佳的化妆液。这种新型化妆液除了与许多传统化妆液一样,能在皮肤上形成薄膜防止水分蒸发外,DHA进入皮肤深层后,还能起到防紫外线灼伤皮肤的功效。2.2用于治疗白斑、白癜风白斑影响美容,研究表明用0.2%5%二羟基丙酮酒精溶液涂于患部,可使其接近正常皮肤。另外,在白癜风白斑处搽二羟基丙酮复合液(二

14、羟基丙酮2.0g,维生素B200mg,二甲基亚砜100ml,照射He-Ne激光10min,治疗处重搽二羟基丙酮复合液,其治疗白癜风总有效率达92.5%以上。二羟基丙酮可直接作为一种抗病毒试剂,如在鸡胚胎培养中,使用DHA能大大抑制鸡瘟病毒的感染,杀死51%100%的鸡瘟病毒。以DHA为中间体在合成相应的衍生物,可具有抗艾滋病病毒的作用。Stanko5等就正常膳食中长期添加DHA和丙酮酸对小鼠机体组成成分影响研究结果表明,实验组鼠体重增加明显减少。尸检发现实验组鼠体脂含量比对照组低32%,而两组鼠的蛋白质和水含量没有显著差异,实验鼠粪便热量损失没有增加,机体代谢率和血甲状腺素水平上升,而脂肪合成

15、速率和血浆胰岛素浓度下降。因此,实验组鼠体重的减少可能是由于储存脂类消耗增加,并以热能形式散失所致。以猪为实验对象,也获得了同样的结果。日本科技人员经过试验证明,猪饲料中加入4%的二羟基丙酮和丙酮酸盐(钙盐的混合物(按3:l的重量比配合,能减少猪肉的脂肪含量,增加瘦肉率。2.6用于二羟基丙酮衍生物的合成7二羟基丙酮分子中含有三种官能团(两个羟基、一个羰基,化学性质活泼,广泛参与诸如聚合、缩合等各种化学反应,是一个重要的化学合成中间体。二羟基丙酮作为中间体用于有机化学合成衍生物时,可用于羟醛缩合反应制取各种手性化合物;经生物或化学法还原可得到具有光学活性的仲醇;直接用于光化学反应中的Diels-

16、Alder加成反应制备糖类化合物或经进一步反应用于该类加成反应;与卡宾发生插入反应;与2,2-二烷氧基环丙烷衍生22第43卷(总第139期李尧微生物发酵生产二羟的丙酮其应用研究进展物作用制备内酯;用于制备一些桥环化合物进而开环得到众多有用的环状化合物。3二羟基丙酮商品规格DHA外观为白色粉末;具有特殊的臭味;熔点为7580(单体和二聚物的混合物,虽然一般状态下是以二聚体(1,4-Dioxane形式存在的结晶,但是,经溶解或加热后则变为单体;可溶于水、乙醇、乙醚和丙酮中。大白鼠急性毒性:LD50>16000mg/ kg。在市售的商品中,有医用级和化妆品级,商品规格表1所示8由于二羟基丙酮及

17、其衍生物在化工、制药、化妆品和食品工业上具有广泛用途,市场前景广阔。国外20世纪6070年代开始用生物转化法工业化生产DHA,如日本的化学工业”公司,独自开发的用甘油发酵制备DHA技术,早在2001年日本国内产量就达到了大约为1.0×105kg/t,其中50%用做医药化工合成中间体,日本国内用做化妆品DHA大约为1.0×104kg/t。2003年,日本DHA医药级价格为40005000日元/kg,化妆品级价格为70008000日元/kg。公司在海外(德国的主要厂商,年生产DHA能力大约为1.0×106kg。与目前国外已实现大规模工业化发酵生产DHA相比较,从国内有

18、关微生物发酵法生产DHA 报道来看3、4、9,发酵生产菌种的产率都不是很高,用于工业化生产相对来说成本一定会比较高,因此目前迫切需要选育DHA高产菌种,提高甘油转化成DHA效率,降低生产成本,早日实现国内工业化发酵生产DHA,以满点国内外市场对DHA的需求。参考文献:1Bories A,Claret C,Soucaille P.Kinetic study and optimisation of theproduction of dihydroxyacetone from glycerol using Glu conobacter oxydans Process Biochemistry,199

19、1,26:243-248.2Asakura A,Hoshino T.Isolation and characterization of a new quinoprtein dehydrogenase,L-sorbose/L-sorboson dehydrogenase Biosci.Biotechnol.Biochm,1999,63(1:46-53的研究.食品与发酵工业J.2003,12(29:40-434冯屏,周家春,严希康,徐玉佩,弱氧化醋酸杆菌静止细胞氧化活性的研究及1,3.二羟基丙酮的制备.食品与发酵工业J.2005,6(31:22-26 5Stanko,R.T.,S.A.Adibi.Inhibition oflipid accumulation and enhancementofenergyexpenditure bythe addition ofpyruvatee and dihydroxyacetone toa rat diet.MetabolismJ.1986,35:182-1866Stanko,R.T.and J.E.Arch