平肝潜阳药物对偏头痛肝阳上亢证患者的临床疗效及其对血淋巴细胞蛋白质表达的影响

1、    【摘要】    目的：观察平肝潜阳药物对偏头痛肝阳上亢证患者的临床疗效和对血淋巴细胞蛋白质表达的影响，为深入研究偏头痛肝阳上亢证病理生理机制及平肝潜阳法治疗作用的分子机制奠定基础。方法：32例偏头痛肝阳上亢证患者随机分为治疗组和对照组。治疗组口服平肝潜阳方，对照组口服氟桂利嗪片剂。治疗2个疗程。观察患者治疗前后的中医症状积分、止痛疗效和不良反应；采用双向凝胶电泳、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法分离和鉴定偏头痛患者外周血淋巴细胞和正常人之间差异蛋白表达，并观察应用平肝潜阳方干预后，各组差异蛋白质表达水平的

2、变化。    结果：平肝潜阳方有明显止痛效果（87.5%），与氟桂利嗪片（75.0%）比较，差异有统计学意义（P    结论：平肝潜阳中药复方有良好的止痛作用，能改善中医症状；可能通过调节部分血淋巴细胞蛋白质的表达治疗偏头痛肝阳上亢证。    【关键词】 平肝; 潜阳; 肝阳上亢; 蛋白质组学; 偏头痛; 随机对照试验 Zhong GW, Li W, Luo YH, Chen GL, Yi ZJ, Hu JJ, Zhang Y, Yin YH, Zhang L. J Chin

3、 Integr Med. 2009; 7(1):2533. Received July 30, 2008; accepted August 12, 2008; published online January 15, 2009. Indexed/abstracted in and full text linkout at PubMed. Journal title in PubMed: Zhong Xi Yi Jie He Xue Bao. Free full text (HTML and PDF) is availyang in treatment of migraine with hype

4、ractive liveryang sydrome and its effects on lymphocyte protein expression: a randomized controlled trial Guangwei ZHONG1, Wei LI1, Yanhong LUO2, Guolin CHEN1, Zhenjia YI1, Jianjun HU1, Ying ZHANG1, Yaohui YIN1, Le ZHANG3 1. Research Institute of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine,

5、Xiangya Hospital, Central South University, Changsha, Hunan Province 410008, China 2. Department of Emergency, Xiangya Hospital, Central South University, Changsha, Hunan Province 410008, China 3. Department of Neurology, Xiangya Hospital, Central South University, Changsha, Hunan Province 410008, C

6、hina Objective: To observe the efficacy of herbs for calming liver and suppressing liveryang in treatment of migraine patients with hyperactivity of liveryang syndrome and to investigate its effects on the lymphocyte protein expression. This approach may lay a foundation for the further investigatio

7、n of pathogenic mechanisms in migraine with hyperactive liveryang sydrome and the curative mechanisms of calming liver and suppressing liveryang treatment. Methods: A total of 32 migraine patients with hyperactivity of liveryang syndrome were randomly divided into treatment group (16 cases) and cont

8、rol group (16 cases). The patients in the treatment group were treated with herbs for calming liver and suppressing liveryang in accordance with traditional Chinese medicine (TCM) theory and the patients in the control group were treated with Flunarizine Capsules for two courses of treatment. The th

9、erapeutic effects, the score of TCM symptom and the changes of headache attack were observed in both groups before and after the treatment. The side effects were also observed in both groups. The level of differential protein expression was analyzed by twodimensional electrophoresis and matrixassist

10、ed laser desorption/ionization timeofflight mass spectrometry (MALDITOFMS). Results: The herbs for calming liver and suppressing liveryang had better effects on headache improvement than the Flunarizine Capsules (P0.01). The cure rates in the treatment and control groups were 87.5% and 75.0% respect

11、ively. Vertigo, restlessness and tantrum, and prosopoheat in the treatment group were also improved as compared with those in the control group (P0.05). After treatment, the score of TCM symptom in the two groups were all decreased (P0.01), and there was a significant difference between the treatmen

12、t group and the control group (P0.01). The herbs for calming liver and suppressing liveryang had no side effects. The average protein spots in the blood lymphocyte of normal people, migraine patients with hyperactivity of liveryang syndrome in the treatment group before and after the treatment were

13、(534±42), (552±54) and (529±55) spots respectively. Six downregulated protein expressions and 14 upregulated protein expressions were obtained in the treatment group. Four strengthened protein expressions in the six downregulated proteins and 11 low protein expressions in the 14 upreg

14、ulated proteins were also obtained after treatment. Ten of the total 12 differential protein spots were successfully identified by MALDITOFMS. The functions of these proteins were involved in metabolism, energy generation, transportation, antioxidation, signal transduction and immune, etc. According

15、 to information provided by NCBI and MSDB database, there were some proteins closely related to migraine with hyperactivity of liveryang syndrome, such as peroxiredoxin 2, heat shock protein 27 and annexin A1. Conclusion: Herbs for calming liver and suppressing liveryang is effective in treating mig

16、raine, and can improve TCM symptoms. The effects on migraine patients with hyperactivity of liveryang syndrome may be related to regulating the blood lymphocyte protein expression. Keywords: calming the liver; suppressing liveryang; liveryang hyperactivity; proteomics; migraine disorder; randomized

17、controlled trials 偏头痛（migraine）在以头痛为症状的疾病中占有很重要的地位，在美国约17.2%的女性和6%的男性曾有偏头痛发作，但仅有48%的患者就诊。肝阳上亢证是偏头痛的常见证型。平肝潜阳药物治疗偏头痛肝阳上亢证有较好的疗效。但平肝潜阳药物治疗偏头痛肝阳上亢证的作用机制目前尚未阐明。我们应用蛋白质组学技术研究了平肝潜阳药物对偏头痛肝阳上亢证患者血淋巴细胞表达的影响。 1 资料与方法 1.1 研究对象 1.1.1 偏头痛肝阳上亢证患者 32例偏头痛肝阳上亢证患者（2005年8月2007年12月中南大学湘雅医院神经内科门诊及住院病人）按就诊顺序随机分为治疗组和对照组各1

18、6例，其中治疗组男性5例，女性11例，年龄1863岁，平均年龄（34.7± 6.2）岁，平均病程（2.1±0.6）年；对照组男性                 6例，女性10例，年龄1963岁，平均年龄（33.8±7.1）岁，平均病程（2.2±0.5）年。两组在年龄和病程方面的差异无统计学意义（P0.05）。 1.1.2 正常人 选取年龄、性别与治疗组、对照组相匹配的健康人10例，并经病史调查、

19、体格检查、心电图及胸片等检查排除心脑血管疾病病史，均为中南大学湘雅医院健康体检中心体检者和本院健康职工。其中男性3例，女性7例，年龄2165岁，平均年龄（33.3±7.4）岁，与上述治疗组和对照组的年龄和性别比较，差异无统计学意义（P0.05）。 1.2 诊断标准 西医诊断标准参考2004年第2版国际头痛疾病分类标准，排除继发性偏头痛。中医辨证及证候判定标准参考中医肝脏象现代研究与临床。主症：（1）眩晕；（2）头痛；（3）面部烘热；（4）烦躁易怒；（5）口苦而渴；（6）脉弦。兼证：（1）耳鸣；（2）五心烦热；（3）失眠；（4）心悸；（5）肢麻；（6）震颤。具备主症中的4项和12项兼症

20、者可诊断为肝阳上亢证。纳入病例标准：（1）年龄1865岁；（2）符合西医偏头痛诊断标准和中医辨证肝阳上亢证者。 1.3 观察指标及疗效评价标准 1.3.1 头痛平均发作次数和平均持续时间 参考国际头痛疾病分类标准。头痛持续时间：记录头痛发作至停止的时间，如果患者疼痛时入睡，到醒来时头痛已消失，则醒来的时间为头痛停止的时间（以小时为计算单位）。无疼痛发作记0分，轻度头痛（发作持续时间12 h）记2分，中度头痛（发作持续时间在1248 h）记4分，重度头痛（发作持续时间48 h）记6分。头痛发作次数：记录治疗前后2个月及随访2个月内头痛发作次数（以月为计算单位）。无疼痛发作记0分，轻度疼痛发作（2

21、次/月）记2分，中度疼痛发作（34次/月）记4分，重度疼痛发作（5次/月）记6分。 1.3.2 止痛疗效判定标准 临床控制为疼痛完全消失；显效为疼痛强度减轻两级，或头痛持续时间缩短2/3；有效为疼痛强度减轻一级，或头痛持续时间缩短2/3；无效为疼痛强度减轻不足一级，或头痛持续时间缩短1/3或头痛加重，持续时间延长。头痛起效和消失时间标准以首次服药时间为基准（以小时为计算单位）。 1.3.3 中医症状评分 眩晕、头痛、烦躁易怒、面目红赤或面部烘热和口苦而渴等主症以及耳鸣、五心烦热、失眠、心悸、肢麻、震颤和腰膝酸软等兼症均按无、轻、中、重、严重评为0、1、2、3和4分。 1.3.4 证候疗效判定标

22、准 参考中医肝脏象现代研究与临床。临床痊愈：中医临床症状、体征消失或基本消失，证候积分减少91%；显效：中医临床症状、体征明显改善，证候积分减少70%90%；有效：中医临床症状、体征均好转，证候积分减少35%69%；无效：中医临床症状、体征均无明显改善，甚或加重，证候积分减少不足35%。积分评分方法采用尼莫地平法，证候积分=（治疗前积分值治疗后积分值）/治疗前积分值×100%。 1.3.5 不良反应 全部患者治疗前后均进行血、尿、粪便常规和心肝肾功能检测，用药后随访期间详细记录可能出现的不良反应，包括症状以及发生、持续和消退的时间。 1.4 治疗药物 治疗组患者服用平肝潜阳中药复方汤

23、剂。平肝潜阳方（自拟方）由天麻12 g，钩藤10 g，石决明20 g，牡蛎30 g，川芎10 g组成，为深圳市三九中药现代有限公司提供的中药颗粒剂型。根据处方剂量将单味颗粒调配成汤剂，200 ml温开水冲服，分2次口服（100 ml/次），2次/d，14 d为1个疗程，2个疗程结束后统计疗效。对照组患者服用氟桂利嗪片剂（西比灵片剂，5 mg/片，批准文号为国药准字h10910003），由西安扬森公司提供，5 mg/次，每晚睡前口服1次，10 d为1个疗程，2个疗程结束后统计疗效。 1.5 试剂 人淋巴细胞分离液，产自天津灏洋生物有限公司；丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、固化pH梯度（immobili

24、zed pH gradient, IPG）干胶条（IPG strip pH310NL，24 cm）均由Amersham Biosciences公司提供；二硫苏糖醇（dithiothreitol, DTT）、甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲酮胰蛋白酶、乙腈、三氟乙酸和基质氰基4羟基肉桂酸（cyano4hydroxycinnamic acid, CCA）均由Sigma公司提供。 1.6 仪器 Ettan DALTSystem垂直电泳槽（Amersham公司），PDQuest 7.0分析软件（BioRad公司），Image Scanner扫描仪（Amersham公司），EXL800自动酶标仪（BilTek In

25、strument，Inc），VoyagerDE STR 4307 MALDITOFMS质谱仪（Applied Biosystem公司）。 1.7 研究方法 1.7.1 样本的收集和制备 1.7.1.1 样本的收集 5 ml静脉血用等量Hanks液稀释后加在淋巴细胞分离液上。离心速度为1 8002 000 r/min，20 min，4 。洗涤2次，离心速度为1 5001 800 r/min，10 min，4 。沉淀物用RPMI1640稀释成适用浓度的淋巴细胞悬液（2×106/ml），随后放入80 冰箱中保存备用。 1.7.1.2 淋巴细胞蛋白质的抽提 淋巴细胞悬液（2×106

26、/ml）加入200 l细胞裂解液57 mol/L尿素，2 mol/L硫尿素，10 mmol/L DTT，4% 33(胆酰胺基丙基)二甲氨基丙磺酸盐，1 mmol/L乙二胺四乙酸，40 mmol/L三羟甲基氨基甲烷，1 mmol/L苯甲基磺酰氟，40 mmol/L Trisbase。室温下静置1 h，4 12 000×g离心60 min，吸取上清液作为细胞的总蛋白。取少许上清液用二喹啉甲酸测血淋巴细胞蛋白浓度，采用Amersham 2D Quant Kit。其余上清液冻存于80 备用。 1.7.2 双向凝胶电泳 1.7.2.1 第一向IPG等电聚焦 IPGDALT主要按IPGphor操

27、作说明进行。淋巴细胞总蛋白质（500 g）与水化液充分混合，加入IPG strip持胶槽，IPG干胶条置入Holder中，再加上覆盖液，以胶条刚好盖住为宜。置于IPGphor等电聚焦仪的电极板上，总电压时间为70 020 Vh，其中水化在30 V低电压进行14 h，然后经过100 V 1 h、500 V 1 h、1 000 V 1 h，最后稳定在8 000 V 8.5 h。 1.7.2.2 第二向垂直十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳 等电聚焦结束后，取出一向IPG胶条，冲洗水化液，置于平衡液A50 mmol/L pH 8.8 TrisHCl，6 mol/L尿素，30%甘油，1%十二烷基硫酸钠（

28、sodium dodecyl sulfate, SDS），0.2% DTT和平衡液B（50 mmol/L pH 6.8 TrisHCl，6 mol/L尿素，30%甘油，1%SDS，3%碘乙酰胺，痕量溴酚蓝）中分别平衡15 min。从平衡管中取出胶条，冲洗。将平衡后的胶条移至0.75 mm厚的12.5%均匀分离胶上端，在其酸性端放置SDS标准蛋白质，用琼脂糖封胶，先设置恒功率2.5 W/块胶电泳30 min，再改用恒功率17 W/块胶电泳至溴酚蓝离胶最底端约1 mm处停止电泳。 1.7.2.3 考马斯亮蓝染色 将经过第二向垂直板十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶（sodium dodecyl sulf

29、atepolyacrylamide gel electrophoresis, SDSPAGE）电泳的12.5%丙烯酰胺胶从制胶板中分离出来，用双蒸水漂洗；再加入考马斯亮蓝染液，水平摇床上染色过夜。 1.7.3 凝胶图像分析 用Image Scanner扫描仪及LabScan扫描软件进行扫描，获取图像。以PDQuest 7.0分析软件进行图像分析。蛋白质表达水平上升或下降200%的点作为目标点，进行鉴定。 1.7.4 质谱分析 1.7.4.1 蛋白质的胶内酶解 蛋白质的胶内酶解参照Fernandez等6的方法并加以改进。将差异显示蛋白质斑点，分别从凝胶上切割下来，用超纯水振动洗涤3次，加入100

30、 l新鲜配制的凝胶脱色液，37 水浴30 min，脱色至凝胶粒无色，小心吸出脱色液，然后加入100%乙氰100 l脱水2次，15 min/次，胶粒置于冷冻抽干仪中抽干，加入510 l胰蛋白酶酶解液，冰上吸胀1 h，每点加入30 l酶解覆盖液37 水浴过                 夜。取上清收集于0.5 ml EP管中，每胶点加入萃取工作液30 l，37 水浴1 h，取上清与前上清混合，冷冻抽干仪抽干后用基质辅助激光解吸电离飞行时间

31、质谱（matrixassisted laser desorption/ionization timeofflight mass spectrometry, MALDITOFMS）测定肽质量指纹图谱。 1.7.4.2 MALDITOFMS 将萃取后冻干的样品用萃取工作液约4 l溶解，用Tips反复在样品液中吸进压出，进行多次循环操作，使样品充分混匀，取0.6 l点于点样板上，每点再加0.6 l CCA基质工作液置空气中自然风干。肽段样品用MALDITOFMS检测，质谱检测是在正离子反射模式中进行，N2激光源，波长337 nm，飞行管长3 m，加速电压20 kV，反射电压23 kV，质谱使用基质峰

32、和胰酶自动降解离子峰作为内部标准校正。 1.7.5 数据库查询 采用Matrixscience公司的Mascot软件搜索数据库。肽质量控制在8004 000，肽片段质量最大误差控制在0.05%，酶解片段不完全选择为1个，物种来源为人体，离子选择M+H和monoisotopic，半胱氨酸经碘乙酰胺处理，信号峰采用Mascot Distiller软件识别。 1.8 统计学方法 采用统计软件SPSS 13.0，计量资料均以x±s表示，采用方差分析；等级计数资料采用秩和检验；计数资料采用2检验。 2 结 果 2.1 头痛平均发作次数和平均持续时间 治疗组和对照组治疗后头痛平均发作次数和平均持

33、续时间较治疗前均明显改善（P 2.2 止痛疗效 32例患者均完成2个疗程的治疗，治疗组总有效率为87.5%，对照组为75.0%，两组比较，差异有统计学意义（P 2.3 中医症状改善情况 治疗组和对照组治疗后各症状均较治疗前明显缓解，差异有统计学意义（P 2.4 中医症状积分的变化 治疗组和对照组治疗后中医症状积分均下降，与治疗前比较，差异有统计学意义（P 2.5 不良反应 在临床观察过程中，治疗组和对照组心、肝、肾功能均未发现明显异常。对照组部分患者服药后出现轻微嗜睡和无力现象，但尚可耐受，未有因不能耐受而退出试验者，其中1例有胃部烧灼感，除外原发胃肠疾病，予以对症处理后症状消失；治疗组未出现

34、明显不良反应。 2.6 血淋巴细胞双向凝胶电泳图谱及差异蛋白质点分析 在相同条件下分别对10例正常人和10例治疗组偏头痛肝阳上亢证治疗前及治疗后的血淋巴细胞总蛋白质进行双向凝胶电泳，采用Image Scanner扫描仪扫描获取图像，然后通过ImageMaster 2D Elite 4.01分析软件对其进行点检测，获得正常人血淋巴细胞和治疗组偏头痛肝阳上亢证治疗前后血淋巴细胞的双向凝胶电泳图谱，其平均蛋白质点数依次为（534±42）、（552±54）和（529±55）。分别将其中的一块胶定为参考胶进行3块凝胶间的蛋白质点的匹配，平均匹配点数为（466±51

35、），其匹配率为86.6%。由此获得了重复性较好的正常人血淋巴细胞和治疗组偏头痛肝阳上亢证治疗前后血淋巴细胞的双向凝胶电泳图谱。见图1。经图像分析统计后发现，与正常人比较，偏头痛肝阳上亢证患者有6个蛋白质表达下调，14个蛋白质表达上调；偏头痛肝阳上亢证治疗前后比较发现表达下调的6个蛋白质中有4个表达增强，而表达上调的14个蛋白质中有11个表达降低。见表5。表5 相关蛋白点在正常组和治疗组凝胶中的相对表达强度 2.7 差异表达蛋白质点的MALDITOFMS质谱鉴定及数据库查询 选取图像分析统计后的差异大于2倍的蛋白质点，胶内酶切提取蛋白进行质谱鉴定。共得到12个肽质量指纹图谱，其中2个无质谱结果，

36、搜索到10个具有统计学意义的蛋白质。7号蛋白质点的肽质量指纹图见图2；经Mascot软件搜索到的7号蛋白质点的评分见图3。初步鉴定的蛋白质按功能进行初步分类，主要有通道蛋白、抗氧化蛋白、专利蛋白、代谢相关蛋白、免疫相关蛋白和细胞信号转导蛋白等。其中鉴定的蛋白分别为乙醇脱氢酶3、免疫球蛋白重链区域、中性粒细胞防御素4前体、黑素瘤相关性E2抗原、专利LOC339483蛋白、免疫球蛋白重链片断、热休克蛋白27、膜联蛋白A1、硫氧还蛋白过氧化物酶2和谷胱甘肽合成转移酶片断。见表6。图2 MALDITOFMS检测的7号差异表达蛋白质点肽指纹图谱 表6 Mascot软件在数据库中检索到的有意义的蛋白 3 讨 论 偏头痛是一种常见病、多发病。流行病学调查发现，女性的患病率为3.3%21.9%，男性为0.7%16.1%。其临床表现为反复发作、单侧搏动性头痛，可伴有恶心、呕吐、视物异常、耳鸣等症状。偏