乙型肝炎表面抗原室内质控系统的建立

1、    乙型肝炎表面抗原室内质控系统的建立        乙型肝炎是我国发病率较高的传染病之一，乙型肝炎的准确诊断和防治与所用诊断试剂质量密切相关。研制生产出高灵敏度、高特异性、质量稳定的乙型肝炎表面抗原(HBsAg)诊断试剂，对乙型肝炎的早期诊治和阻断血液传播具有重要意义，我们参照国家质控标准品，标定并建立了室内HBsAg酶免试剂参考品，对进一步监测和提高诊断试剂的质量起到重要作用。 1材料和方法1.1材料及来源购自中国药品生物制品检定所的HBsAg阳性血清1份(80 ng

2、/ml)，灵敏度血清4份(0.2 ng/ml、0.5 ng/ml、1 ng/ml、2 ng/ml)，特异性血清20份，精密性血清1份，不同亚型阳性参比品3份。所有血清均采自献血员，经放射免疫测定法(Radio-immunoassay RIA)检测筛选出HBsAg阳性血清8份，阴性血清58份。全部血清经56 10 h灭活，3 000 r/min离心15 min，20保存备用。HBsAg试剂盒分别为本实验室、上海科华和厦门新创公司生产。检测仪器为奥地利SLT-型酶标仪。1.2灵敏度系列参比品的制备将中检所80 ng/ml HBsAg阳性标准品和5份HBsAg阳性混合血清分别倍比稀释至最低检测限浓度

3、，用酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测，找出被标定血清与标准品相对应的吸光度A值，经3次重复实验后，反推标定血清的HBsAg含量，并以标定过的移液管、容量瓶及含保护剂的稀释液，将其准确稀释到与国家标准品相应的含量0.2 ng/ml、0.5 ng/ml、1 ng/ml、2 ng/ml、100 ng/ml，经再次ELISA重复检测，确定其含量，经t检验，差异无显著性后分装，20冻存备用，为本室HBsAg灵敏度质控参考品。1.3特异性标准血清的筛选收集58份正常献血员血清，同时用三个不同厂家HBsAg试剂经ELISA法检测，选出平均A值在0.050.09之间的阴性血清，再经RIA试剂(北京生物制品

4、研究所)检测HBsAg为阴性的20份血清，经中和试验确证为HBsAg阴性，分装20冻存备用，作为本室HBsAg阴性特异性质控参考品。1.4阳性参比标准血清的筛选选出3份阳性稀释终点在1014万倍之间的HBsAg阳性高值血清，分装后20冻存，作为本室HBsAg阳性质控参考品。1.5精密性标准血清的制备将HBsAg阳性血清稀释到HBsAg含量接近临界值3 ng/ml，测定A值在0.20.3之间，并连续测定10孔，计算变异系数(CV值)，作为本室HBsAg精密性质控参考品。1.6HBsAg室内参考品的核验以三个不同厂家HBsAg ELISA试剂，分别检测HBsAg国家标准品和标定的室内参考品，分析重

5、复性、准确性和稳定性。2结果2.1室内参考品与国家标准品灵敏度的对比结果见表1。标定后计算出5份HBsAg阳性混合血清HBsAg含量为70 g/ml，将此混合血清稀释为灵敏度系列参比品，灵敏度以参比品HBsAg最小检出量表示，国家HBsAg灵敏度标准品有四个浓度，分别为0.2 ng/ml、0.5 ng/ml、1 ng/ml、2 ng/ml，对试剂灵敏度要求达到1 ng/ml为合格产品，从表1可看出，本室标定的参考品与国家标准品A值相近，经t检验，t值为2.604，小于t0.01(3)5.841，P0.01，两者之间差异无显著性。2.2室内参考品与国家标准品线性相关性的比较将中检所80 ng/m

6、l标准品倍比稀释7孔至最低浓度0.313 ng/ml，本室标定的100 ng/ml参考品倍比稀释8孔至最低浓度0.39 ng/ml，做ELISA检测，根据HBsAg含量及测定的A值绘制曲线，观其拟合程度。结果，在低含量段即0.3135 ng/ml之间拟合最佳，而后一段5100 ng/ml本室参考品的A值比中检所的A值略高一些。因此在低含量段的灵敏度参考品标定比较准确。见1。2.3三种国产试剂对特异性参考品的核验结果经国家批批检定的三个厂家试剂对20份室内特异性参考品检测A值范围分别为：本实验室0.040.09，科华0.050.09，新创0.040.09，其中4份阴性高值血清，三个厂家检测结果A

7、值均为0.080.09；比其他阴性血清A值略高，三种试剂对室内特异性参考品的检测结果无一例假阳性出现。表1不同浓度国家标准品与本室参考品ELISA测定结果(A值)Tab.1ELISA results of the National standard HBsAg reference sera and thelaboratory reference HBsAg sera (A value)标准品Reference seraHBsAg含量(ng/ml)HBsAg content(ng/ml)12国家标准品National standard HBsAg reference sera本室参考品Labor

8、atory HBsAg reference sera     2.4不同厂家试剂对室内参考品的检测结果用三种市售经“国家批批检定”合格试剂，同时检测本室建立的HBsAg参考品，检测结果与“国家批批检定”结果一致，结果见表2。2.5室内参考品在生产中的应用室内HBsAg参考品建立以来，用HBsAg ELISA试剂常规生产的质量控制和监测，对控制和提高试剂质量起到至关重要的作用。1995年以来本室生产的11批HBsAg酶免试剂经“国家批批检定”，结果合格率100%，见表3。 3讨论诊断试剂质量好坏，直接影响临床检测结果的准确与否，因此建立一套室内参考品监测产

9、品质量非常重要，其中灵敏度直接反映试剂盒的检测下限、灵敏度过低可造成HBsAg阳性病人的漏检；特异性标准品共20份，数量较多，目的是控制检测中真阴性检测结果，防止假阳性造成误诊给病人和家属带来不必要的思想负担；阳性参比品是防止一步法ELISA检测中高滴度HBsAg阳性标本漏检的重要参比标准；精密性则是检验诊断试剂重复性的重要指标，以评价试剂的批内精密性或重现性。在室内参考品标定制备过程中，对几个重要指标本着使用方便、准确的原则，采用严谨的实验方法，将室内参考的浓度直接稀释为工作浓度，使用时不再稀释以减少实验误差。本室自建立室内参考品以来，始终用于日常室内质量控制工作，及时纠正生产和实验中各种因

10、素造成的质量偏差，保证并提高了试剂的质量。1995年以来本室HBsAg酶免试剂连续11批参加批批国家检定，各项技术指标均达到或超过国家标准。其中9批产品灵敏度低于1 ng/ml的国家标准，达0.50.2 ng/ml；精密性符合15%的国家标准；20份特异性血清未出现假阳性结果；3份不同亚型强阳性血清从未出现后带漏检现象，检定合格率达100%。    1室内参考品与国家标准品线性相关Fig.1Linear correlation between laboratory reference HBsAg sera andNational standard HBs

11、Ag reference sera表2不同厂家试剂对室内参考品的检测结果Tab.2The laboratory HBsAg reference sera tested with HBsAg reagents of different factories厂家Factory灵敏度(ng/ml)Senstivity(ng/ml)特异性(+/-)Specificity(+/-)阳性参比Reference(-/+)精密性(CV%)Accuracy本室Laboratory0/200/3科华Kehua0/200/3新创Xinchuang0/200/3     表3连续

12、11批HBsAg酶免诊断试剂的检定结果Tab.3Identification of 11 batches of HBsAg enzyme immunodiagnostic reagents批号Batch质量检定技术指标Technical indexes for quality control灵敏度(ng/ml)Sensitivity(ng/ml)特异性(+/-)Specificity(+/-)阳性参比Reference(-/+)精密性(CV%)Accuracy9500160/200/3119600020/200/37960918-1050/200/39960918-20/200/3119702

13、110/200/3139707180/200/389712080/200/39805110/200/369810030/200/349901180/200/3109906160/200/38国家标准National standard0/200/315%     本室制备的参考品用国内三个不同厂家试剂反复进行核验比较，无一例假阳性和假阴性，灵敏度均在1 ng/ml以下，CV值均15%，与用国家标准品测定的结果一致。结果表明本室参考品标定和制备是成功的，含量及其使用性能稳定，做为企业质量评价尺度，在产品质控中起到决定性作用，提高了产品质量。几年来本中心生产的HBsAg ELISA试剂检测卫生部临床检验中