产沼气微生物低温发酵研究分析

1、产沼气微生物低温发酵技术研究一、立项依据(一) 项目的目的及意义沼气推广及应用中的问题沼气是我国农村目前最有发展前景的可再生能源，对减少农村废弃资源，由于应用较早、范围广、发酵工艺和发酵技术相对成熟以及容易掌握，沼气的开发利用为减少环境污染、降低碳排放，减轻农民燃料负担，保护和改善生态环境起到巨大的作用。在全国各地农村，沼气池的建造正以燎原之势在广大农村发展起来，据统计截至2006年底中国已建成的户用沼气总数已超过2200多万个1，2009年底突破3000万个2。2008年至2009年底，两批新增沼气项目已累计建成户用沼气280多万户、各类沼气工程8750座2。在新的一年，2010年中央一号文

2、件再一次强调“加快推进农村户用沼气、大中型沼气和集中供气工程建设，加强沼气技术创新、维护管理和配套服务。支持农村开发利用新能源，推进农林废弃物资源化、清洁化利用。” 但是，在大量的沼气池建立起来的同时，沼气生产技术尚存在一些问题需要解决，其中最重要的就是低温发酵产气的问题。目前，在我国西部、西北部、东北、华北等地区，冬春季或者高原地区温度常年较低，沼气池产气不足甚至不产气，每年有数月不能正常产气4，5，再加上秸秆类原料相对丰富而禽畜排泄物相对不足，碳氮比例不协调，造成沼气池启动时间长、转化率低的问题，进一步影响沼气池的正常产气3。低温条件下难以产生沼气这个问题仅影响了农民对发展沼气的信心和积极

3、性，对沼气事业的推广、国家节能减排的推进也带来不利影响。现有应用方案多集中在沼气池保温、加温方向，尝试把低温问题转向中高温度来解决，但这样并不符合生态经济效益，违背了发展沼气作为绿色可再生的初衷。 沼气低温研究的目的以及意义本项目拟通过筛选研究针对低温厌氧条件下具有水解能力的单菌株以及驯化的低温产甲烷菌群，研究低温沼气发酵过程中微生物间的相互作用，筛选优化出低温产甲烷复合菌群和优化低温沼气发酵参数；拟开发完成一种适用于冬季平均温度10-15沼气池的复合菌剂及相关配套实施技术，为减少低温沼气池的启动时间、提高底物转化效率、增加稳定沼气产量提供一套实用性强、成本低廉的解决方案。该项目的成功顺利实施

4、，将增强人民群众特别是广大农民对发展沼气的积极性，巩固人们对沼气使用的信心以及对国家一贯惠农政策的支持和理解；项目的科技成果的顺利转化将能促进农村废物利用、节能减排、保护和改善农村生态环境，对沼气事业的推广、国家节能减排的推进带来积极正面的影响。(二) 国内外技术发展现状与趋势沼气的产生是由多种不同类型微生物协同作用将有机物的厌氧分解产生甲烷（CH4）的过程6，与好氧发酵只需要一种微生物不同6，厌氧发酵需要一系列具有类似与食物链关系的微生物群落来完成。一般认为沼气的产生包括了三个步骤7：厌氧水解过程、酸生成过程以及甲烷生的生成，不产甲烷菌为甲烷菌创造适宜的氧化还原条件，而甲烷菌对VFAs和氢气

5、的利用为不产甲烷菌解除了反馈抑制，构成一个复杂系统11。而温度则是影响沼气产生量的重要影响因子9，而按照不同发酵温度，可分为低温（嗜低温）厌氧发酵（10-20）、中温厌氧发酵（20-45）、高温（嗜高温）厌氧发酵（45-60）14,现在大部分对于低温发酵沼气的研究集中在5-207，9，12，13。一方面，自然界中大部分甲烷是在低温环境下形成，随着嗜冷产甲烷微生物的分离（最低生长温度-2-5）等一系列的研究，已证明嗜冷消化的可行性25。另一方面，生态学者认为各种低温生态系统中,低温条件下的甲烷生成由嗜冷产甲烷古菌群落与其他微生物群落的相互营养作用决定26：Conrad等15认为低温影响CH4产生

6、的主要原因是降低了产H2细菌的活性，而对产甲烷细菌的影响相对较少；丁维新等6认为在一定温度条件下，提高底物浓度（乙酸或者氢气）有助于增加甲烷的产生；叶发斌24进一步提出不产甲烷菌对有机物分解利用的速度决定了产甲烷菌产甲烷的速度，为了进一步提高沼气产量，提高水解菌群对有机物的水解速度，尤其是对纤维素的分解速度，比继续富集产甲烷菌更为重要。因此，通过添加特定低温水解菌群的菌株或者驯化的菌群，可为增加低温下沼气产量提供一个方向7，8。 而目前关于低温水解及产酸过程的微生物研究的集中在中温条件下纤维素水解方面，一般水解步骤由严格厌氧的梭菌属（Clostridia）或兼性厌氧的链球菌（Streptoco

7、cci）等各种各样的土壤细菌9来完成，Attar等17对沼气池添加经筛选的纤维素水解放线菌，使沼气产量提高8.4-44%。Geeta等18发现甘蔗渣中添加白腐菌（Phanerochaete chrysosporium）在混合牲畜排泄物能明显增加产生的沼气量；马诗淳5经过筛选一株分解纤维素细菌并将其添加到其实验室的厌氧降解纤维素产甲烷复合菌系CBC中，在中温条件下具有较高纤维素降解率，甲烷产量提高10%以上。邓宇等23登记了一种厌氧降解纤维素产甲烷的复合菌专利，由13种菌组成分为厌氧、兼性厌氧纤维素分解菌、发酵性细菌、互营菌、产甲烷菌五大类群，在中温条件下具有较高纤维素降解率，提高了沼气产量。另

8、外，王艳芹等21开发了一种低温产沼气复合菌剂，由荧光假单胞杆菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、环状芽孢杆菌组成，适合以秸秆为主或在温度在10正常发酵的沼气池中添加，能使沼气产量大幅提高27。但需要指出，前三种细菌为好氧菌或兼性厌氧菌，仅环状芽孢杆菌具有较明显的厌氧纤维素分解能力。除了对单一菌株的研究外，王敦球等19针对低温条件（3-17）对猪粪产沼气进行菌群复配研究：添加厌氧水解菌群发酵产气量提高28%，而添加厌氧纤维素分解菌群的产气量则只提高24%，而两者均添加则可以提高32%以上，说明了低温发酵过程添加一定量的微生物菌剂对产沼气产量有明显的促进作用，而其对秸秆等纤维素为主的发酵原料则有待进一

9、步研究。除了水解菌群的低温驯化外，产甲烷菌在低温下的多样性和不稳定性，各菌群之间的协作还需要进一步研究。Sekiguchi等44的研究发现低温条件下产甲烷菌的种类较多,并且以只能利用乙酸产CH4的甲烷毛菌(Methanosaetaceae)为主，而利用H2产甲烷的甲烷杆菌属（Methanobacterium），甲烷球菌属（Methanococcus）以及甲烷微菌属（Methanomicrobium）等受到抑制；Nozhevnikova15，16研究表明，在牛粪中添加了经1年半驯化的低温产甲烷菌群，在15下甲烷产量增加30%，6下更增加超过10倍，但随着温度上升至中温后两者基本没有差别，其认为经

10、过长时间低温筛选出嗜冷菌群或者令普通的中温菌群产生低温适应性，同时，他也指出这个菌群对温度上升非常敏感，容易失去低温下保持的平衡，并且让嗜中温或高温菌群迅速占据生长优势，低温适应性也随之减弱，因此从中温转入低温发酵时，有必要额外添加冷适应菌群加快菌群调整。目前研究添加经低温驯化的单水解菌株或菌群能增加低温下沼气的产量，但仍存在一些问题。但是就单菌种而言，可以有针对性的筛选具低温厌氧蛋白质、纤维素分解能力的菌株，但部分菌株不容易得到纯培养（或不可培养），许多研究只重视菌株的分离以及实验室条件下的沼气产量，而没有注意配合实际发酵原料，菌株加到沼气池后，发酵过程中该菌株的活性以及所起到得作用没有得到

11、进一步的研究；就低温驯化菌群而言，可以解决部分不可培养细菌（特别是产甲烷菌）的问题，但驯化周期较长、微生物互生关系复杂，对不同底物的以及温度变化适应性有限，不利于改进和优化发酵条件；另外，添加额外的水解菌种可能破坏原来低温驯化菌群内在的平衡性，添加细菌种类以及添加条件有待进一步明确。(三) 项目产业化前景分析生物质能是重要的可再生能源，且洁净环保，可以减少化石能源消耗带来的温室效应，降低碳排放，减轻农民燃料负担，保护和改善生态环境起到巨大的作用。2010年中央一号文件再一次强调“加快推进农村户用沼气、大中型沼气和集中供气工程建设，加强沼气技术创新、维护管理和配套服务。支持农村开发利用新能源，推

12、进农林废弃物资源化、清洁化利用。” 在低温环境下对沼气池的添加额外保温或者加温措施显然会陡然增加使用沼气的成本，增加维护难度，不符合成本经济效益，而从生物学角度研究出发，通过探索低温厌氧发酵的微生物机理，通过实验严格筛选和驯化适应低温条件微生物复合菌群，才能从根本上解决低温沼气发酵问题。u 市场需求目前全国已建成2200多万个沼气，有相当的数量分布在西部、华北及东北地区农村，而受自然条件的影响这些地区冬春季温度较低持续时间较长，使得绝大大部分沼气池处于低产或不产沼气的状态，这保证了低温沼气发酵技术有着广泛的市场需求。而这些地区对沼气池的建设成本较为敏感，应避免或尽量减少额外得投入，通过生物技术

13、高效且低成本解决沼气低温发酵问题，能广泛惠及全国各地农村，增加农民使用沼气的积极性和信心，巩固国家前期大力发展沼气的成果，符合国家“加强沼气技术创新、维护管理和配套服务”的政策引导，带动相关产业联动发展。u 研究技术水平在总结国内外研究成果的基础上，本研究创新性地将低温蛋白质与纤维水解菌株的筛选与低温厌氧产甲烷的驯化相结合，针对国内农村沼气发酵的原料特点对菌株与菌群进行复配，减少筛选时间增加筛选效率，突破现有研究仅采用纯菌株或低温驯化菌群的技术局限；并且通过探索低温水解菌在低温厌氧发酵过程所起的作用，为筛选甲烷刺激因子与实际低温沼气池试验提供理论依据，为该复合菌群的进一步技术改进与产业化奠定良

14、好的实验基础；本研究的顺利开展与成功实施，其成果将能达到国内领先技术水平，国际先进水平。u 研究技术产业化能力、市场化前景与经济效益分析本项目依托于华南理工大学完善的微生物实验设备与工业发酵专业综合研发能力，以华南理工大学广东省发酵与酶工程重点实验室为技术基础，结合顺德生产力促进中心的研究成果产业转化优势，具有良好的产业化能力和广阔的市场化前景。从技术上分析，工业微生物发酵技术成熟，活性复合菌剂产品技术可靠，可用于小规模试生产和低成本的大规模生产。该类复合菌剂产品市场针对性强，起点技术水平较高，容易扶持成具完整的知识产权的自主品牌，与之类似竞争产品极少：目前仅一项类似技术的产品具有专利，但总体

15、技术水平较低，不具有与拟开发产品的竞争力。从市场前景来说，国内具有巨大的沼气池保有量，过半数处于温带地区对低温发酵技术有明显需求，是一个千万级别市场的需求潜力，有着广阔的市场前景；此外，国外也存在整体生活水平较低的高原、寒温带农牧地区，如尼泊尔、中亚、中南美洲地区，同样面临着低成本燃料的选择、农业废弃物处理等问题，具有广阔的海外市场开拓前景。从相关产业带动方面，由于解决好低温沼气发酵问题，调动了广大农民的对沼气池建设的积极性和增强对沼气发展的信心，可直接带动微生物菌剂制造行业的发展，还同时拉动沼气池建相关的建材行业、沼气池设备维护服务产业的发展，而沼气燃具和照明灯具设计生产行业也能由于市场的扩

16、大而直接受益，同时由于沼气设备使用频率的增加相关企业要更着力技术的提升和新产品开发和完善维修服务，最终带动行业相当一段时间内稳定的效益增长。u 研究社会效益分析本研究技术的顺利实施，将强力推进相关产业如微生物菌剂、燃气炉具、基建、技术服务行业的发展，改善相关产业的中长期就业，沼气应用的进一步推广更有利于农村生态环境的改善，配合沼气池渣转换肥料技术则有更利于农村的废弃资源的合理循环利用，在此基础上对改善农民生活环境，保障农村公共健康有着长远正面的作用。二、研究开发内容、方法、技术路线(一) 主要研究内容l 分离纯化具低温厌氧分解蛋白质或纤维素的单菌株，低温驯化产沼气菌群为了解决加速低温条件下沼气

17、产生的速率，首先必须加快底物厌氧水解的速率，为此拟对如下内容进行详细研究：以冬季正常产沼气的沼气池渣为原始菌种，一方面添加适当底物并在10-15下进行长时间驯化发酵，挑取产气量较多的低温驯化菌群；另一方面在低温厌氧条件下筛选出水解能力较强的单菌落，再进行纯化及初步鉴定分类。l 基于已分离的单菌株与驯化后的菌群进行复配组合，挑选高产气组合在单菌种加快水解速度的同时，需要与产甲烷菌群协作解除底物的反馈抑制：根据各单菌株特性，分别将蛋白降解菌株与纤维素降解菌株与低温驯化后的菌群进行第一轮复配，选取适合添加比例并根据产甲烷量选取产气量较高或添加少量即可明显增加产气量的单菌；然后组合两种或三种单菌与菌群

18、进行第二轮复配，挑选出产甲烷量较高产量稳定的组合。 l 低温产甲烷刺激因子的筛选以及对微生物生理、群落结构的影响，优化低温产甲烷条件初步研究菌株组合的，拟选定三类低温产甲烷刺激因子：水解关键酶或结构类似物（羧化酶、蛋白酶、纤维素酶）、生长代谢底物（氮源、碳源，不同底物的碳氮比）、金属螯合剂及酸度调节剂对低温产甲烷的复合菌群的在发酵沼气过程中的生理以及物理化学的影响；群落结构的影响则分为原单菌种在添加过程中数量的变化分析和菌群结构的变化分析，拟在此刺激因子以及低温沼气池试验的基础上优化低温产甲烷条件。l 在复合菌群和刺激因子的基础上进行低温沼气池试验寻找温度合适稳定的沼气池，通过对比分析发酵试验

19、，研究在实际沼气发酵条件下复合菌群所能起到的作用；对提高产沼气的效率的刺激因子进行分析，考虑实现难度和成本进行筛选和复配。(二) 拟解决的关键技术l 建立稳定的筛选和驯化平台寻，有效筛选水解菌种和产气菌群低温水解菌种筛选以及低温产甲烷菌群的驯化受外界影响较大，而冬季能产气的沼气池能提供较佳的耐冷菌群以供筛选以及驯化，因此建立一个建立稳定且快速有效的筛选和驯化平台既能准确筛选出目的菌株又能提高筛选效率，并且为研究菌落结构变化以及优化参数提供有力的保证，是本课题成功实施的关键；l 研究水解菌株在低温厌氧发酵下的生长情况及对菌群结构变化的影响低温下微生物之间的微生态与产物代谢平衡较为脆弱，低温条件添

20、加菌株与菌群复配成复合菌群后，额外的微生物可能对原产甲烷的菌群产生不定向的影响，如何检测准确反映实际微生物的变化是本课题的另一关键问题。(三) 拟采用的方法、技术路线以及工艺流程本研究拟采取的技术路线图如图1所示。以实验室试验为主，以普通沼气池试验为辅分开进行，依据实验室筛选和驯化的情况，选取适合的菌株与菌群进复配以及菌落结构等研究，同时在低温沼气池进行验证试验；最后通过综合试验优化产甲烷条件：(1) 低温沼气池渣样品选择：拟采集遵义市郊区农村正常产气沼气池池渣样本（年平均气温12.613.1），地处向阳坡面4-6个样本，向阴坡面1-2个样本；本地（广东）正常常温产沼气池样本2-3个（对照）。

21、(2) 低温厌氧水解菌种的筛选以及低温产甲烷菌群驯化： 低温厌氧水解菌种的分离纯化：取适量样本在10-15下经初步富集20-30d，稀释至适当浓度后利用酪蛋白、CMC可溶性纤维素平板在低温厌氧条件培养观察5-10d，酪蛋白平板直接挑取形成透明圈的单菌落，CMC平板经刚果红染色后挑取形成透明圈位置的菌落，水解圈较多时挑取半径较大的菌落； 单菌株的初步鉴定及生理生化分析：单菌落经连续划线平板培养4-5低温沼气池样品分离纯化单菌株单菌株数量及影响因素分析DGGE菌落结构分析低温厌氧驯化单菌或多菌与低温菌群复配低温厌氧筛选低温蛋白质水解低温蛋白质水解低温产甲烷菌群菌株初步鉴定生理生化分析纯种菌株选定低

22、温厌氧产甲烷复合菌群底物物理化学变化分析低温沼气池试验刺激因子筛选以及复配实际应用研究分析蛋白质以及纤维素水解菌群在沼气低温发酵中的作用反馈代，观察菌落形态特征和验证其水解稳定性，进行革兰氏染色，接触酶，氧化酶，碳源试验以及显微镜镜检，测定菌株培养物的蛋白酶或可溶性纤维素/滤纸酶活，重点区分和界定菌株种类；（拟分离低温厌氧蛋白水解菌株3-5株，纤维素水解2-3株；） 低温产甲烷菌群的驯化：在自制厌氧发酵装置中将10%沼气池液样本混合秸秆和动物排泄物，在8-10下低温驯化90-100d，利用排水法收集产生气体，气相色谱检验甲烷含量，挑选产气量较多的菌群。(3) 单菌株与菌群的复配，复合菌群的构建

23、以及分析： 单菌株菌群的复配以及复合菌群的构建：第一步先将单菌株与菌群复配，分别挑选增加产气量较高的厌氧蛋白质水解和纤维素水解菌株；第二步将两种水解能力的菌株与菌群复配，拟挑选稳定产气对底物具较广泛适用性的复合菌群；针对复合菌群进行发酵过程分析：利用平板法测定水解菌株的生理变化；测定底物pH、固形物含量，利用凯氏定氮发测定总氮/可溶性氮含量、利用排水法测定总产气量并利用气相色谱检定甲烷含量。 复合菌群的群落结构分析：首先利用苯酚氯仿法提取总DNA，再利用PCR扩增细菌16S rDNA的V3区域基因，利用变性梯度凝胶电泳系统（DGGE技术）对样品中微生物多样性进行分析。(4) 刺激因子筛选与复配

24、，发酵条件优化 刺激因子筛选与复配：拟选定三类低温产甲烷刺激因子：水解关键酶或结构类似物（羧化酶、蛋白酶、纤维素酶）、生长代谢底物（氮源、碳源，不同底物碳氮比）、金属螯合剂及酸度调节剂对复合菌群在低温条件下产甲烷的影响，利用排水法收集气体以及气相色谱检验甲烷含量。 发酵条件优化：在考虑成本因素的条件下对，针对有效的刺激因子对低温发酵沼气进行优化甲烷产量，再根据试验结果对发酵刺激因子的组合或用量进行适当调整。(5) 低温发酵池试验： 低温发酵池的选定以及准备：选择1-2个月内温度平均气温在15，高低波幅在5之内的的沼气池；选定并填充适当的发酵底物（秸秆动物排泄物）和普通沼气池渣，并作温度、pH值

25、等的初步测定，确保各池间初始发酵环境一致； 发酵参数条件选择以及发酵过程的控制：根据初期发酵进度，适当对沼气池选择添加不同刺激因子，做好发酵试验过程沼气池的温度管理，防止温度过低影响试验结果；按试验计划对气压、所产沼气燃烧质量进行观察记录，并按2至3日采集保存气体样本，加料时采集保存池渣样本，实验结束后统一对样品进行集中分析对比； 发酵参数的调整，复合菌群的效用分析：根据沼气池试验效果分析发酵参数的实际效果，结合成本对发酵参数作最后的调整。可行性分析(1) 根据初步试验结合国内外专家理论，通过添加驯化微生物能并明显增加中高温下甲烷的产量，并能缩短厌氧发酵启动时间，而部分针对低温厌氧发酵的研究也

26、有相类似的结果；(2) 自然界中低温产沼气客观条件存在，符合低温水解蛋白质和纤维素的菌株以及适应低温厌氧产甲烷菌群也客观存在，通过菌株与菌群的复配能较为迅速驯化出较有针对性的复合菌群，但必须重视低温菌群容易受到温度升高影响而不稳以及研究菌株对底物的适应性等问题，才能最大限度地发挥添加复合菌群的作用；(3) 通过深入研究水解菌株在厌氧发酵过程中的变化，以及与复合菌群之间的关系和相互作用，筛选产气刺激因子是提高低温甲烷产量的有效途径，然后通过低温沼气池试验拟提高刺激因子的针对性和作用；(4) 以上实验方法及配套仪器的使用本实验室均已掌握(四) 项目的特色和创新突破点l 通过针对低温蛋白质水与和纤维素水解单菌株的分离纯化，以及低温