天水师院论文

1、天水师范学院毕业论文（设计）多糖测定的研究进展李宗萍（天水师范学院 生命科学与化学学院 甘肃 天水 741001）摘 要：多糖是除了蛋白质和核酸以外在生命有机体中不可缺少的成分，它已在各个领域得到应用。随着多糖的作用越来越突出，人们对其重视程度也日渐加深，研究多糖性质的测定方法也愈显重要。本文主要从多糖的来源，提取，分离纯化，含量、结构及相对分子质量的测定方面进行综述。本文期望为多糖的高效利用提供一些依据。关键词：多糖；相对分子质量；结构；含量The Research Progress of Polysaccharides DeterminationLi Zongping(School of

2、Life Science and Chemistry of TianShui Normal University, Gansu, TianShui, 741001)Abstract: The polysaccharides is an indispensable ingredient in addition to proteins and nucleic acids in living organisms, and it has been applied in various fields. With the increasingly prominent role of the polysac

3、charide, its emphasis is also deepening the study of the nature of the polysaccharide measurement method is also more and more important. The source of the polysaccharide, extraction, purification and determination of relative molecular mass, structure and content were summarized in this paper. Some

4、 useful information for the efficient use of the Polysaccharides was provided in this paper. Keywords: Polysaccharides The relative molecular mass Structure Content引言多糖（Polysaccharides）是一类天然产物，广泛存在于动物、植物和微生物等有机体中，是一切有机体不可缺少的成分，与维持有机体的各种生理机能有着密切的联系1。目前具有降血压、降血脂、降血糖、抗肿瘤、抗病毒、抗衰老、抗凝血、抗溃疡等作用。多糖又称多聚糖，是由醛糖

5、或酮糖通过脱水形成糖苷键，并以糖苷键线性或分枝连接而成的链状聚合物，对其测定的研究在生命体的研究起着重大的作用1-2。1. 多糖的来源多糖种类繁多，来源广泛。主要包括动物多糖、植物多糖、微生物多糖。动物多糖来自动物结缔组织基质和细胞间质。植物多糖来源于植物的根、茎、叶、皮、种子和花。微生物多糖主要来源于真菌的菌丝体细胞壁和细胞质中、子实体及其发酵液中3。2. 多糖的提取、分离、纯化和降解2.1 多糖的提取 大多数多糖是以氢键、盐键等与其它物质聚合在一起，所以必须以各种有效方法破坏多糖链与其它物质的共价结合，才能达到提取多糖的目的4。多糖的提取方法很多，植物多糖多采用水提法、有机溶剂提取法、超声

6、波技术及微波辅助技术。对于动物多糖，一般采用丙酮、乙醚、乙醇进行预处理，进行脱脂5-6。2.1.1 水提法多糖属极性较强物质，溶于热水。故常用水提法，水提法多应用于中性多糖，提取糖醛酸类的酸性多糖可以用弱碱性水溶液。另外，在酸性条件下，多糖中糖苷键可能断裂，提取时应尽量避免7。2.1.2 有机溶剂提取法该方法的原理是利用多糖溶液与有机溶剂互不相容，且多糖在有机溶剂的溶解度大于多糖在原溶剂的溶解度，经过多次萃取将多糖从原溶剂中转移至有机溶剂中，然后通过蒸发等手段出去有机溶剂，得到多糖。2.1.3 超声波技术及微波辅助技术超声波技术及微波辅助技术是近年研究比较多的一种高效率的方法，超声波提取植物多

7、糖是利用超声波产生的机械振动、乳化、击碎、化学效应等的空化作用加速植物有效成分的溶出，利于提取8。微波提取则是利用微波场中介质的偶极子转向极化和界面极化的时间与微波频率相吻合的特点，促使介质转动能级跃迁, 加剧热运动，将电能转化为热能，从而使细胞壁破碎或溶解，达到增强提取效率的目的9。如超声波催化纤维素酶法提取灵芝多糖8-9。目前的困难是此法的工业生产设备尚未普及。2.2 多糖的分离多糖分离过程一般包括蛋白质、色素及低聚糖等小分子杂质的去除。根据多糖的不同性质，其分离方法也不同。多糖的溶解度与多糖的分子量有关，分子量小的，溶解多一般较大，分支越多的直链多糖的水溶性越好，多糖具有较强极性，在其水

8、溶液中加入乙醇、丙酮或甲醇等沉淀剂，即可产生沉淀。故可以根据溶解度的不同可以分为：乙醇沉淀法和含盐溶液沉淀法。多糖分子中含有如羟基及硫酸基等不同的电离基团，因此可以根据电离性质的不同可以分为：季铵盐络合法和电泳分离法10-11。此外，还有离子交换、层析法凝胶色谱、分子筛色谱、高效液相色谱（HPLC）法、膜分离法等。尤其是膜分离法不需加热和化学物质处理，不仅节约能源、无环境污染，且保留生物活性成分的高效价，因而得到广泛的应用。2.3 多糖的纯化纯化是将多糖混合物分离为单一多糖的过程,是多糖分离进一步的处理工作。其纯化方法主要有化学法和物理法12。化学法主要是依靠加入化学物质使非多糖类物质发生沉淀

9、，从而纯化多糖。其方法主要有：分部沉淀法、盐析法、金属络合物法和季铵盐沉淀法等。物理法主要是根据填料对不同种类糖的吸附作用的差异性，而使各糖分达到彼此分离的方法。常见色谱法包括凝胶柱色谱法和离子柱交换色谱法13。另外，纸层析法和冷冻法也是纯化多糖的有效手段。2.4 多糖的降解对多糖组成进行定性和定量分析时，先用酸催化水解多糖，使其还原为单糖或寡糖，再进行分析。化学降解常用的方法有：NaNO2降解、酸降解以及氧化降解。其中，酸降解最为常见，最常用的酸是盐酸、硫酸和三氟乙酸。例如利用色谱方法进行检测时，由于酸和盐往往干扰色谱分离，所以常需用中和、沉淀及透析等形式消除干扰。此外，甲醇分解、甲醛分解作

10、用、乙酰分解作用和酶水解等方法也可用于多糖降解14-15。3. 多糖含量的测定多糖含量是利用糖的还原性进行测定。常用的方法有化学法和色谱法。化学法主要包括苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法，DNS法，咔唑-硫酸法，滴定法等，色谱法主要包括薄层色谱（TLC）法，液相色谱（HPLC）法，气相色谱（GC）法，红外光谱（IR）法等。3.1 化学分析法3.1.1苯酚-硫酸法苯酚-硫酸试剂可以同多糖中的己糖和糖醛酸、游离的寡糖起显色反应。糖在浓硫酸作用下，先水解成单糖, 再脱水生成具有呋喃环结构的化合物。五碳糖和六碳糖一般生成糠醛和5-羟甲糠醛。糠醛酸在此条件下往往脱羧，并生成糠醛。糠醛及其衍生物和苯酚缩合成有色

11、物质，在480nm处有最大吸收，吸收值与糖的含量呈线性关系，根据其在曲线上的位置推算出多糖的浓度从而推算其含量16-17。此法操作简单、快速、灵敏、重复性好, 对每种糖仅需制作一条标准曲线即可，但对有色样品结果易偏高4。3.1.2 蒽酮-硫酸法此法的原理是利用糖类与浓硫酸在沸水浴中脱水后，生成糖醛或其衍生物, 再与蒽酮试剂缩合，反应后形成蓝绿色溶液，于620nm处有最大吸收，吸收值与糖的含量呈线性关系。再根据其在曲线上的位置推算出多糖的浓度从而推算其含量18-19，但是蒽酮-硫酸法稳定性较差。3.1.3 咔唑-硫酸法该法主要用于糖醛酸的测定，其原理在于多糖经水解氧化生成糖醛酸，糖醛酸在硫酸存在

12、下会与咔唑发生缩合反应，生成含羰基的紫红色产物。该产物在530 nm下有最大吸收，各中性单糖在0.040.32mg/mL，糖醛酸在0.010.08mg/mL范围内，其浓度与咔唑法检测吸收值呈线性，吸收值与糖含量呈线性关系20。3.1.4 DNS法（3, 5-二硝基水杨酸比色法）在碱性条件下，利用3, 5-二硝基水杨酸与多糖水解产物还原糖共热后，被还原成氨基化合物，呈橘红色，于540nm处有特征吸收21。在一定范围内还原糖的量与反应液的颜色强度呈比例关系，通过比色测定糖含量。该法可测定还原糖和总糖含量，并通过多糖+还原糖=总糖，可获得多糖含量22。3.1.5 滴定法滴定法测定的原理是取多糖水解液

13、，加入指示剂，用标准溶液滴定，根据样品水解液所消耗体积及化学反应计量关系计算其含量23。该法主要包括氧化还原滴定法、间接碘量滴定法、斐林氏滴定法等。3.2 色谱法3.2.1气相色谱（GC）法通过气相色谱法可以定性、定量对多糖的组分和含量分析，一般是将多糖酸水解或甲醇醇解，用衍生物法以增加其挥发性。在GC分析中，糖有两类衍生物，一类是三甲基硅醚衍生物，是通过糖在二甲基亚砜或吡啶等非水溶剂中与三甲基氯硅烷，六甲基二硅烷，双三甲基硅烷基乙酰胺等反应形成，此类衍生物均具有较强的挥发性。另一类糖衍生物是醋酸衍生物，包括醋酸乙醛肟衍生物，三氟醋酸盐多羟基醇衍生物，三氟醋酸多羟基醇衍生物等24。填充柱和毛细

14、管色谱柱是气相色谱分析法中常用的色谱柱。在糖分析中主要采用OV-1701、OV-17、OV- 225、SE-30、SE-33、SE-52、DB-1701、DB-1、HP-1701和AT-1701等25。被分离产物的检测常采用选择性好、灵敏度高的检测器，最常用的氢火焰离子化检测器（FID），具有最高的选择性和灵敏度。此外也用到火焰光度检测器（FPD）、质谱检测器（MS）、电子捕获检测器（ECD）等23。3.2.2 液相色谱（HPLC）法 糖的高效液相色谱分析方法已成为常规分析方法。可对单糖和寡糖进行常量和微量分析。对于一般的单糖、寡糖的分析，色谱柱一般用氨基键合固定相。常用的氨基键合色谱柱有碳水

15、化合物柱、Amino-sil-X-1、Amide-80、Hypersil NH2、Lichroeorb-NH2、Polygosil 60-5NH2、YMG-NH2和ZORBAX氨基柱等。通常用乙腈和水作为流动相，随着水的比例的减少，糖的保留时间亦减少26。此外，C8和C18硅烷色谱柱和阳离子交换柱（通常以聚苯乙烯型阳交换色谱树脂制作）也用于糖的分析，一般以水作流动相，在较高温度（7585）下，分离效果较好25。HPLC常用的检测器有紫外检测器（UV）、荧光检测器（FLD）、电化学检测器（ED）、蒸发光检测器（ELSD）等。3.2.3 薄层色谱（TLC）法薄层色谱，亦称薄层层析，属于固液吸附色谱

16、。样品在薄层板上的吸附剂和溶剂之间进行分离。由于各种化合物的吸附能力各不相同，在展开剂上移时，它们进行不同程度的解吸，从而达到分离的目的。再利用双波长薄层扫描技术测定多糖中单糖组成，建立单糖浓度和斑点面积的定量关系，以此对样品中各单糖作定量分析。薄层层析有分离效果好、操作简便、分离速度快(13h)、样品需要量较少(500ng1g)，检测限可达到µg级等优点。另外，利用高效薄层色谱(HPTLC)，进行薄层扫描，检测限可达到ng级27。3.2.4 红外光谱（IR）法红外光谱定量分析多糖是通过对特征吸收谱带强度的测量，用标准曲线法、求解联立方程法等方法来求出各组份含量。其理论依据是朗伯-比

17、耳定律：A=abc，式A为吸光度，它没有单位；a称作吸收系数。当浓度c选用mol·L-1为单位，槽厚b以厘米为单位时，则a值的单位为：L·cn-1·mol-1，称为摩尔吸收系数，并常用表示。利用傅里叶变换红外光谱估测多糖含量时18，一般认为糖量的特征波在970cm和1182cm之间。Blakeney等4用近红外反射光谱测定了谷物中非淀粉多糖，这种方法既快速又便宜，在快速分析具有营养功能的重要多糖方面具有很大的潜力。此外，随着检测仪器不断革新升级，多糖含量的检测还有一些其他方法。其发展趋势使检测过程更简便、准确、快速、实现痕量检测等。4. 多糖结构的测定多糖的结构复

18、杂，分初级结构和高级结构，一级结构为初级结构，二、三、四级结构为高级结构。科学家们多年来通过从物理、化学和生物等手段对其结构进行研究，已取得很大进展，而新技术的发展使得分析手段更快速更高效。本文主要从化学分析方法和物理分析方法进行阐述。4.1 化学分析方法4.1.1 酸水解法酸水解是鉴定多糖的单糖组成常用的方法。它又分完全酸水解与部分酸水解，现在酸水解法已实现完全自动化，通常多糖的酸水解条件是用13mol/L硫酸或2mol/L三氟乙酸，80100密闭加热68h，若多糖中含又糖醛酸，则需要更加强烈的水解条件。当水解完成后，用氢氧化钡或硫酸钡等碱液中和，进而用色谱分析28。4.1.2 高碘酸氧化法

19、多糖具有邻二醇、邻三醇结构而易被高碘酸盐氧化开环。高碘酸可以选择性地断裂多糖分子中连二羟基或连三羟基，使其生成相应的多糖醛、甲酸或甲醛。反应定量进行，每断裂一个C-C键消耗一分子高碘酸29。其原理主要是通过高碘酸氧化多糖的作用，测定高碘酸的消耗量、甲酸的生成量和剩余糖含量的比，从而确定多糖中糖苷键的键型、比例、糖苷键的位置以及支链多糖的分支数目。4.1.3 Smith降解法其原理主要是通过用稀酸在室温下将高碘酸氧化产物还原后的多元醇进行部分酸水解，由于糖基之间以不同的位置缩合，用高碘酸氧化后则生成不同的产物。将氧化产物用硼氢化合物还原成稳定的赤藓醇糖苷或丙三醇糖苷等多羟基化合物，经酸水解后用纸

20、色谱或气相色谱鉴定水解产物，这些单糖苷、二糖苷和寡糖苷的结构有助于推断多糖中单糖的部分连接顺序和键型30。4.1.4 甲基化反应法甲基化反应是通过确定糖苷键的位置和各单糖的组成、比例，阐明单糖的连接方式、重复结构中某种单糖的数目、末端糖的性质及分支点的位置等。首先将多糖中的各种单糖残基中的游离羟基全部甲基化，其次将多糖中的糖苷键水解，水解后得到的化合物的羟基所在位置即为原来单糖残基的连接点。最后根据不同甲基化单糖的比例推测出这种连接键型在多糖重复结构中的比例31。4.2 物理分析法4.2.1 红外光谱( IR) 法红外光谱法在多糖结构分析上主要是确定吡喃糖的苷键构型及常规观察其他官能团32。一

21、般主要观察730960 cm-1范围，如对于-吡喃糖，C1-H为845cm- 1，而-吡喃糖C1-H为890cm-1。4.2.2 气相色谱（GC）法气相色谱法用于糖类的定性分析及定量测定。糖可通过酸水解或甲醇解成单糖或单糖苷，然后采用三氟乙酰化、三甲基硅烷化、糖醇乙酰化等方法衍生化，即可进样分析。GC分析多糖虽受到样品挥发性和热稳定性的限制，但GC-MS可使多糖结构分析的灵敏度提高。另外常将GC与HPLC结合来分析多糖水解后单糖的组成及比例33。4.2.3 质谱（MS）法 质谱法用于鉴定各种甲基衍生物的碎片及各种单糖残基的连接位置。已成为解决与碳水化合物有关的结构问题的有力工具34。早期的质谱

22、主要局限于电子解离法（EIMS），不适用于糖类这种极性强。而近年来，发展快速的软电离技术质谱由于其灵敏度高和结构信息直观，而受到人们更广泛的青睐。如电喷雾电离、化学电离、场致电离和场解吸电离、基质辅助的激光解吸电离。此外，对于极性高、难挥发且热稳定性不高的多糖，可用快原子轰击质谱。4.2.4 核磁共振光谱（NMR）法 NMR主要解决多糖结构中糖苷键构型问题。糖链的结构特征通过化学位移、积分面积、偶合常数及弛豫时间等参数来表达。常用的有1H-NMR和13C-NMR，它们常用于测定呈现在重复单元中不同糖数目的差向构型。13CNMR的化学位移较1HNMR大，分辨率高，不但能确定各种碳的位置，而且还能

23、区别分子的构型和构象35。NMR技术研究的优点是保证样品的完整性。4.2.5 X射线衍射其原理是利用X-射线纤维衍射和计算机模拟结合，再联合立体化学的知识来确定多糖的构型。由于绝大多数的多糖都不能形成单晶，故不适用于常规的X-射线单晶衍射，X-射线纤维衍射在多糖的结构测定方面起了重大作用，X-射线纤维衍射与计算机模拟技术相结合是当前确定多糖立体构型最为有力的工具36。5. 多糖相对分子质量的测定多糖的性质往往与相对分子量大小有关。如多糖溶液的粘度，不仅随溶液浓度的增大而增大，并且与相对分子量大小也有关，而且在生物学上由于多糖分子量的不同，所产生的某些效应也有一定的差异。目前测定多糖相对分子量的

24、方法主要有凝胶色谱法、端基法、粘度法、渗透压法和超滤法等。 5.1 凝胶色谱法该方法的原理是用苯酚-硫酸法监测，用已知分子质量的葡聚糖标准品进行凝胶层析，洗脱，收集。在测定中洗脱体积为Ve，当分子量足够大，过凝胶柱时不进入凝胶的洗脱体积为死体积V0，分别求得相对应的洗脱体积Ve，通过标准曲线上的Ve/ Vo，查得待测多糖的相对分子质量对数，便可求出相对分子质量37。5.2 端基法基本原理是测定单位重量样品中所含可测端基之数，计算检样的分子量。常用的测定多糖还原端基的定量分析方法有：3, 5 二硝基水杨酸比色法、碱性铜盐试剂反应滴定法和多糖转化为氰醇测定法等38。例如，对某一种多糖的分子结构，如

25、果已经知道其每一个分子链含有一个可测端基和每毫克中所含的可测端基为Ymmol，则它的分子量为1/Y。即检样的分子量是每毫克检样重量中所含可测端基的毫摩尔数的倒数，在端基法测定分子量时，分子量计算的通式是：检样的分子量=检样重量mg/可测端基（mmol）。5.3 粘度法 粘度法测定分子量先是测定样品特性粘度G，然后通过换算方程，即经验式G=KM计算分子量39。该方法所需设备简单，操作方便，有相当好的实验精度，因此常用于多糖分子量测定。但是此法中所用的特性粘度与分子量的经验方程要根据多糖的性质（分子量范围、溶剂种类等）来确定。5.4 渗透压法 渗透压法是利用膜渗透压计测定范围在在1万50万之间的多

26、糖分子量。其原理是半透膜只允许小分子物质（如水）通过，而多糖分子不能通过半透膜，将多糖溶液装入用半透膜制成的透析袋中，由于袋内的多糖溶液浓度高，袋外的水分子会渗入袋内，从而形成一定的渗透压。渗透压与溶液中的溶质分子数有关，用范特荷甫公式表示，即V=nRT，式中：渗透压；V：溶液体积；n：溶液摩尔数；R：气体常数；T：绝对温度。采用渗透压法测定分子量时，要求样品内不含分子量小至能 透过半透膜的物质40。如灵芝菌丝体多糖的分子量测定。5.5 超滤法 超过滤，又名分子过滤，是在常规微粒过滤基础上发展起来的细微粒子过滤新技术，应用适宜的分子量截留值的超过滤膜，以各种已知分子量不同的多糖作标准进行超滤测

27、百分滤过量，然后以百分滤过量对分子量作图得出标准曲线， 在相同超过滤膜和相同测定条件下测定样品的百分滤过量，从标准曲线上即可求出近似的分子量41。6. 研究展望多糖不仅是生物体必不可少的成分，而且广泛参与细胞的各种生命活动而产生多种生物学功能，虽然较蛋白质、核酸研究的晚，但由于它在生命过程中不可忽视的作用使得它越来越受到关注。但是由于多糖的复杂性以及研究手段的局限性，使得多糖的研究还不是很成熟，尤其是多糖在人体内的机理问题，目前应用于临床的多糖已在抗突变、抗凝血、降血压、降血脂等方面展现出了诱人的前景。它作为药物具有其它药物难以相比的优势毒副作用小，具有多方面的功能，而且现在多糖已在食品、化妆

28、品、医药、保健品和环境治理等研发中成为重要组成部分。因此，建议充分利用对多糖的测定研究，使其在各个领域得到更加广泛的应用。参考文献1 姚新生. 天然药物化学M. 第三版. 北京: 人民卫生出版社, 2002. 53106.2 王镜岩, 朱圣庚, 徐长法. 生物化学(上册) M. 3版. 北京: 高等教育出版社, 2002.3 方积年, 丁侃. 天然药物多糖的主要生物活性及分离纯化J. 中国天然药物, 2007, 5 (5): 339347.4 张惟杰. 糖复合物生化研究技术M. 杭州: 浙江大学出版社, 1999. 128.5 崔亦华, 崔英德, 易国斌. 应用广泛的天然多糖及其提取方法J.

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