痛泻要方抑制大鼠离体结肠平滑肌收缩的钙动员机制

1、痛泻要方抑制大鼠离体结肠平滑肌收缩的钙动员机制         09-12-13 16:03:00     编辑：studa20              作者：袁建业, 谢建群, 吴大正, 郑昱, 潘相学, 费晓燕, 徐海珍【摘要】  目的：从影响钙动员角度，探讨痛泻要方抑制大鼠结肠平滑肌收缩的作用机制。方法：应用离体平滑肌张力测定方法

2、，观察痛泻要方对乙酰胆碱（acetylcholine, ACh）、氯化钾（KCl）和细胞内钙库耗竭后细胞外Ca2+内流引起的大鼠结肠平滑肌收缩的影响。结果：痛泻要方能够抑制KCl和细胞内钙库耗竭后细胞外Ca2+内流引起的大鼠结肠平滑肌收缩，并呈浓度依赖性。3 000 g/mL 痛泻要方还能抑制ACh引起的第二收缩时相张力，与不加药的对照组（Krebs液）比较，差异有统计学意义（P<0.01）；痛泻要方对ACh引起的第一收缩时相张力无明显影响。结论：痛泻要方主要通过抑制胞外Ca2+内流来抑制大鼠结肠平滑肌的收缩，可能涉及到阻断电压门控钙通道、钙库调控性钙通道和受体操纵性钙通道，但不影响AC

3、h引起的胞内Ca2+释放。 【关键词】  痛泻要方; 结肠; 平滑肌; 钙动员; 大鼠Objective: To study the relationship between the inhibitory effects of Tongxie Yaofang, a compound traditional Chinese herbal medicine, on the contraction of the colonic smooth muscle isolated from rats and calcium mobilization.Methods: By measuring th

4、e tension of the isolated colonic smooth muscle strips, the inhibitory effects of Tongxie Yaofang on the contraction induced by acetylcholine (ACh), KCl and exhausting Ca2+ of internal calcium store were assessed respectively.Results: Tongxie Yaofang could concentrationdependently inhibit the contra

5、ction of isolated rat colonic smooth muscle strips induced by KCl and exhausting the Ca2+ of internal calcium store. Tongxie Yaofang could also inhibit the tension of the second contractile phase induced by ACh (P<0.01, vs control), but had no influence on the first contractile phase.Conclusion:

6、Tongxie Yaofang can inhibit the contraction of isolated rat colonic smooth muscle strips mainly by preventing the influx of extracellular Ca2+, which may be associated with blocking voltagedependent channel, storeoperated channel and receptoroperated channel, but not by preventing the release of int

7、ernal Ca2+ from calcium store.Keywords: Tongxie Yaofang; colon; smooth muscle; calcium mobilization; rats痛泻要方是中医治疗“痛泻”证的名方，最早见于丹溪心法·卷二1。许多临床研究报道以痛泻要方为基础方治疗腹泻型肠易激综合征取得良好疗效2，3。药理实验表明，痛泻要方对大鼠、兔等实验动物的肠平滑肌收缩具有抑制作用4，5，但具体作用机制尚不完全清楚。本实验从钙动员角度探讨痛泻要方抑制大鼠离体结肠平滑肌收缩的作用机制。1  材料与方法1.1  实验动物  1

8、8只健康成年SD大鼠，雄性，清洁级，体质量200300 g，购自中国科学院上海实验动物中心，动物使用许可证号为SYXK（沪）20070005，饲养在上海中医药大学实验动物中心，实验前禁食24 h，不禁水。1.2  药物与试剂  痛泻要方（由白术、白芍、陈皮、防风组成），生药饮片一次性购自上海华宇药业有限公司；乙酰胆碱（acetylcholine, ACh），购自Sigma公司（批号为97H2649）；EGTA（ethylene glycolbis(aminoethylether)N,N,N',N'tetraacetic acid），购自Sigma公司（批号为

9、E4378）；毒胡萝卜内酯（thapsigargin），购自Sigma公司（批号为T9033）；Krebs液（NaCl 115 mmol/L、NaHCO3 25 mmol/L、KCl 2.4 mmol/L、KH2PO4 0.6 mmol/L、CaCl2 1.2 mmol/L、MgCl2 1.2 mmol/L、glucose 10 mmol/L），除NaHCO3为Sigma公司产品外，其余所用试剂均为国产分析纯。无钙Krebs液，即Krebs液去掉CaCl2。1.3  仪器设备  PowerLab/4SP数据处理与分析系统、MLT02021D型张力传感器，购自澳大利亚ADI公

10、司；501C型超级恒温水浴箱，购自上海实验仪器厂；电热恒温水温箱，购自上海医疗器械五厂；自制的离体张力测定灌流系统。1.4  痛泻要方的制备  按比例（白术白芍陈皮防风=321.51）称取一定量的饮片，加8倍体积的水，煎煮3次，每次1 h，合并3次水煎液过80目筛，然后将滤液浓缩至生药含量为12 g/mL。加入乙醇使乙醇浓度达90，静置过夜，取上清液，用旋转蒸发仪回收乙醇后将药液置入真空干燥箱内干燥，并研末装入密封袋内备用。1 g生药得到0.105 g提取物。实验时用Krebs液或无钙Krebs液配制成所需浓度的溶液。1.5  实验内容与方法1.6  统

11、计学方法  计量资料数据以x±s表示。运用GraphPad Prism 4软件对数据进行统计分析、作图。两组数据的比较采用Studentt检验，多组数据间比较采用单因素方差分析进行检验，P<0.05表示差异有统计学意义。2  结果2.1  痛泻要方对高钾引起的肌条收缩的影响  100 mmol/L KCl引起肌条张力增高，且能维持在一较稳定水平，加Krebs液后无明显变化。痛泻要方浓度依赖性地降低KCl增加的肌条张力，当浓度加至1 000 g/mL时，痛泻要方组的肌条张力下降水平与对照组比较，差异有统计学意义（P<0.01）。在痛泻

12、要方浓度为10 000 g/mL时，肌条张力降至加痛泻要方前的35左右。说明痛泻要方能抑制KCl引起的肌条收缩。见图1。2.2  痛泻要方对细胞内钙库耗竭后细胞外Ca2+内流引起的肌条收缩的影响  细胞内钙库耗竭后，外钙内流引起的肌条收缩表现为较稳定的张力增加，增加的幅度远比KCl诱发的低。加入痛泻要方或Krebs液后，前者肌条张力迅速下降，而后者只是略有下降。当痛泻要方浓度为1 000 g/mL时，痛泻要方组的肌条张力下降水平与对照组比较，差异有统计学意义（P<0.01）。当痛泻要方浓度为10 000 g/mL时，几乎完全抑制了肌条收缩。说明痛泻要方可以抑制细胞内钙

13、库耗竭后Ca2+内流引起的肌条收缩。见图2。2.3  痛泻要方对ACh引起两个收缩时相的影响  经3 000 g/mL提取物孵育后，ACh引起的第二收缩时相（即复钙后）增加的张力低于对照组（P<0.01）；而ACh引起的第一收缩时相（即在无钙Krebs液中）增加的张力与对照组比较，差异无统计学意义（P>0.05）；经300和1 000 g/mL的痛泻要方提取物孵育后，ACh在无钙Krebs液中增加的张力及复钙后增加的张力与对照组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。图1  痛泻要方对KCl引起的肌条收缩的抑制作用（略）Figure 1&

14、#160; Inhibitory effects of Tongxie Yaofang on contraction of muscle strips induced by KClData were represented as x±s. n=6. *P<0.01, vs control.图2  痛泻要方对细胞内钙库耗竭后细胞外Ca2+内流引起的收缩的抑制作用（略）Figure 2  Inhibitory effects of Tongxie Yaofang on contraction of muscle strips induced by exhaust

15、ing Ca2+ of internal calcium storeData were represented as x±s. n=6. *P<0.01, vs control.表1  痛泻要方对ACh引起的两个收缩时相的影响（略）Table 1  Effects of Tongxie Yaofang on two phases of the contraction induced by ACh*P<0.01, vs Krebs group.3  讨论    Ca2+在介导平滑肌收缩反应中起核心作用。平滑肌细胞的收缩依赖于胞浆中游离Ca2+浓度（Ca2+i）的升高。Ca2+i的增加来源于细胞外液Ca2+ 内流或细胞内贮存Ca2+释放。对于这两种钙离子动员途径而言，细胞外Ca2+内流在结肠平滑肌收缩中起主要的作用7。细胞外钙离子内流主要通过三种钙通道：电压门控钙通道（voltagedependent channel, VDC）、钙库调控性钙通道（storeoper