马铃薯遗传转化方法(protocal翻译)

1、重庆大学本科学生毕业设计（论文）附件 附件C：译文农杆菌介导的马铃薯遗传转化体系Steve Millam摘要：马铃薯是一种全球性的重要农作物，其块茎作为营养丰富的食物，产量很高。马铃薯之所以成为大量研究的焦点，是因为它既作为一种主要粮食作物，又能作为所关注的化合物的潜在重要来源。转基因技术的发展和应用已经用于马铃薯上，并以此来引进基础且实用的新奇目标特征。本文描述了一个快速、高效和低成本的马铃薯遗传转化系统，与平常的转化相比，其转化效率可超过40%。基于核酸印迹法的平均值计算，证实了每个外植体切片在转基因上的独立性。将节间切片与农杆菌一起培养，然后在卡那霉素的筛选下，经历一个双阶段的愈伤组织诱

2、导/出芽系统。用这种描述的方法可以获得很高的幼芽再生率，而且经过2次继代培养后，离体茎段从伤口末端生根，保证有95%的外植体被转化。这种转基因状态可以通过分子分析来证实。马铃薯的块茎生长也促使了大范围的进一步的研究。1介绍马铃薯是最早用于遗传转化的植物之一。Ooms等人在1986年用农杆菌浸染马铃薯Desiree品种的组织并使组织再生，这成为马铃薯转化的直接证据。转基因品种Desiree和Bintje所用的农杆菌由Stiekma等人提供。de Block报道了一种以叶圆片作为靶组织，且与基因型无关的转基因方法。Visser等人以茎段和叶片为外植体，提出了包括再生和转化在内的两步法，并作为目前众

3、多已使用的实验方案的基础。各种马铃薯组织相对容易的根系再生也支持了这些已经报道的马铃薯遗传转化系统。目前许多正在使用的实验方案都报道了一个两步再生法，及先进行愈伤组织诱导，再进行根系再生。在愈伤组织诱导阶段通常会尽可能避免马铃薯体细胞突变。第一步通常是加入1-5mg/L的玉米素（zeatin）或者玉米素核苷（zeatin riboside），并结合低浓度的生长素（通常是0.1-0.2mg/L的萘乙酸（NAA）或者吲哚乙酸（IAA）,以此促进外植体产生愈伤组织。第二步，将玉米素浓度降低20%，将生长素浓度降低10倍，同时加入赤霉素来刺激根系再生。每个外植体的再生速率都很高，经过4-6周可生出第一

4、批根，培养10-12周后可每个外植体都会长出至少10条根。以卡那霉素（kanamycin）或者潮霉素（hygromycin）作为筛选标记可以很容易地用肉眼进行分析，然后切除可能与转化无关的根。那些含有抗生素抗性基因的苗将会很明显从茎的切口处长出根，而那些非转基因的苗将不会生根或者从不定位点生根。使用不同的栽培品种或者组织，其转化效率也不同。但是根据重复实验的记录显示，从最初的外植体到确定的转基因单株的比率在40%到100%之间。尽管马铃薯通常是四倍体，但也经常使用双单倍体品系进行转基因研究。此外，野生的二倍体植株也用此方法进行转化。虽然许多的初步报道都基于模式植物的研究，但转化成功的基因型的范

5、围也在不断扩大。在众多马铃薯品种中筛选具有转化潜力的品种的研究中，科学家发现了一个有意思的现象，即转化效率与转化潜力无关。最近几年，马铃薯的研究重心将集中到转基因的发展，包括赋予抗病虫害能力，提升块茎质量，以及提升淀粉产量。2材料2.1植物材料马铃薯Desiree品种的试管苗（来自苏格兰农业科学局SASA，网址是.uk/ 或其他机构）确保最初使用的是脱毒苗。脱毒苗可以选择用马铃薯发芽的块茎培育的试管苗，或者温室中长势相同的马铃薯植株。2.2生长调节剂母液提前准备好充足的生长调节剂母液用于配制16×250mL的完全培养基。母液先用过滤方式消毒，然后分

6、装到无菌离心管中，并置于-20中保存，可以保存6个月。1萘乙酸（NAA）（Duchefa）：将20mg NAA溶解到1mL 1N的NaOH溶液中，再加蒸馏水定容至20mL，配成1mg/mL的NAA母液。NAA母液可于4保存6周。2赤霉素（GA3）（Duchefa）：将20mg GA3溶解到20mL 50%的乙醇（乙醇与蒸馏水的比例为1:1）中，配成1mg/mL的GA3母液。GA3母液可于4保存6周。3米素核苷（ZNR）（Duchefa）：将20mg ZNR溶解到1mL 1N的NaOH溶液中，再加蒸馏水定容至20mL，配成1mg/mL的ZNR母液。ZNR母液可于-20保存6个月。2.3抗生素母液

7、1头孢霉素（Claforan，Cefotaxime powder，Roussel，Uxbridge，England）：用蒸馏水配制125mg/mL头孢母液，并用过滤方式消毒。母液可于-20保存6个月。2卡那霉素（Duchefa）：用蒸馏水配制50mg/mL卡那霉素母液，并用过滤方式消毒。母液可于-20保存6个月。3利福平（Sigma）：用甲醇配制50mg/mL利福平母液，不需要过滤方式消毒。母液可于-20保存6个月。2.4培养基所有的培养基都准备了250mL，分装至Durand bottles中，并在121下高压蒸汽灭菌20分钟，同时对抗生素进行过滤消毒。然后在超净工作台中，先将生长调节剂母液

8、加入培养基中，再分装至10个9cm的培养皿中。1. 植物生长必需培养基（BM）：1×MS基本培养基加上维生素混合物（Duchefa product no.M022），20g/L蔗糖，用蒸馏水定容至1L，并调节pH至5.8。加 入8.0g/L的琼脂粉，经高压蒸汽灭菌后，于4保存。2. MS20培养基：即液体BM培养基，成分和上面相同，但是不加琼脂粉。3. 共培养基（CM）：在BM培养基中加入0.2mg/L的NAA，0.02mg/L的GA3，2.5mg/L的玉米素核苷（ZR），8g/L的琼脂粉。4. 第一阶段再生培养基（CMC）：在CM培养基中加入500mg/L的头孢霉素（已用过滤方式灭

9、菌）。5. 第二阶段再生培养基（CMCK）：在BM培养基中加入0.02mg/L的NAA，0.02mg/L的GA3，2mg/L的玉米素核苷（ZR），500mg/L的头孢霉素（已用过滤方式灭菌），50mg/L的卡那霉素（已用过滤方式灭菌）。6. 选择培养基（SM）：在BM培养基中加入500mg/L的头孢霉素（已用过滤方式灭菌），50mg/L的卡那霉素（已用过滤方式灭菌）。7. LB培养基：10g/L的胰蛋白胨；10g/L的酵母提取物；10g/L的NaCl，pH= 7.5；18g/L的琼脂粉。2.5细菌菌株和载体1农杆菌菌株LBA4404。2DNA构建体：pBIN19的双元载体衍生物。载体通过电击转

10、化进入LBA4404中。成功转化的细菌能够选择性地在含有100mg/L的卡那霉素和利福平的LB培养基上生长。农杆菌菌液需加入甘油，置于-80保存。2.6其他物品和溶液1灭菌剂：10%的Dmomestos（Lever Brothers，UK），其有效成分为1.0%的次氯酸钠。2混合肥：爱尔兰苔藓腐殖土（bedding grade），1200L；Pavoir沙，100L；石灰石（magnesium），2.5kg；石灰石（calcium），2.5kg；sincrostart基肥（William Sinclair， Lincoln，UK），1.5kg；Celcote湿润剂（LBS Horticultu

11、re，Lancashire，UK）,1.5kg；珍珠石，100L；Osmocote控释肥（Scotts，UK），2kg；Intercept杀虫剂（Bayer），390g。3方法3.1培育试管苗所有的试管苗都置于18-22，16小时光照（光照强度为80-110E/m2/s），8小时黑暗环境下培养。3.1.1用发芽的块茎培育试管苗1将块茎上的芽切下，并用自来水冲洗。2先将切下的芽置于加有2滴吐温20的70%乙醇中浸泡1分钟，然后用10%的Domestos浸泡15分钟，再用无菌水清洗5遍，最后放在BM培养基中培养。3用装有BM培养基的90mm培养皿或者组培瓶对茎段和芽尖进行继代培养。3.1.2用温室

12、中正在生长的植株培育试管苗1选择生长旺盛，且未受到病虫害侵袭的植株，将其茎段和芽尖剪下，并立即用自来水冲洗。2先将茎段和芽尖剪成5至10mm的小段，然后用加有2滴吐温20的70%乙醇漂洗1分钟，接着用10%的Domestos浸泡15分钟，再用无菌水清洗5遍，最后放在BM培养基中培养。3用装有BM培养基的90mm培养皿或者组培瓶对茎段和芽尖进行继代培养。3.2准备农杆菌1从用甘油保存的菌液或者含有100mg/L卡那霉素和利福平的LB平板培养基上挑取菌种，并置于5mL发酵培养基中活化。2将农杆菌加入5mL含有100mg/L卡那霉素和利福平的LB培养基中，然后放在摇床上，28，200rpm过夜培养。

13、3过夜培养后，用250mL的锥形瓶将5mL的菌液转入50mL含有相应抗生素的LB培养基中，用相同的条件过夜培养。4过夜培养后，测量农杆菌悬浮液的光密度（OD）值为600nm。5将菌液加入无菌离心管中，700-1000g离心15分钟，然后用15mLMS20重悬沉淀。6同时，用650L之前摇的菌液和350L甘油混合，配成1mL菌液，用液氮速冻后，置于-80保存。3.3接种、转化和再生1从生长3-4周的马铃薯植株上截取长约10mm，切面直径不低于2.5mm的 节间部分。2将外植体（数量不低于30个）放在装有MS20培养基的平板中，避免干燥。3在90mm平板培养皿中加入15mLMS20培养基，再加入1

14、mL之前摇的菌液，然后将外植体放入培养皿中，用封口膜密封，置于细菌恒温摇床中，22，50rpm转化45分钟。4将农杆菌悬浮液倒入容器中，并使农杆菌失活。5用无菌滤纸将外植体表面的水分吸干，然后置于CM培养基上（每个平板上放30个外植体）。将平板密封后，在18-22，弱光处（光照强度为20E/m2/s）转化48小时。6然后将转化好的外植体置于CMC培养基上进行共培养，每个平板上的外植体应低于10个。将平板密封后，在18-22，充足光照处（光照强度为80-110E/m2/s）培养。712天后，将CMC培养基中的外植体转移到CMCK培养基中进行培养。8每14天更换一次新的CMCK培养基。9愈伤组织和

15、丛生芽在4周后出现，然后继续培养。当大约第三次换CMCK培养基时，小心剪下5-10mm左右的丛生芽，然后置于SM培养基中。10继续每14天转移一次外植体，同时剪下后长出丛生芽，确保每个芽发育成单独的植株。3.4选择和进一步生长转基因的丛生芽1在SM培养基中培养14天后，移出存活的苗（即那些仅从芽的伤口处长出根的苗）。剪取10-15mm的芽尖，然后放在新的SM培养基中进行2次筛选。2那些从切口处生根的植株可以认为是已成功转化的。接下来就可以将这些植株放在SM培养基上进行共培养，最后转移到温室中进行培养。Fig. 1. (A) 培养6周后从5mm的Desiree外植体茎段长出的丛生芽。照片的放大倍

16、数为3倍。(B) 将可能转化的芽切下，放在含有50mg/L卡那霉素的MS培养基上培养14天后，可以看到左边的小苗长出根，因此推断是阳性植株。而右边的小苗未生根，因此推断是未成功转化的植株。照片的放大倍数为3倍。3当根系发育良好的试管苗长到4-5个茎节时，洗掉多余的琼脂，就可以移栽到装有混合肥的3L花盆中，并放到温室中，控制温度在15-20（光照强度为150E/m2/s，光周期为16小时），并保持土壤湿润，时间为2天。4若仔细遵循上述步骤，移植成功率通常能达到100%。生长旺盛的植株在开花期应每周施加液体肥料（1:1:1 N:P:K）。最后每个植株通常都能结7-10个薯块。5可以在低温条件下（暗

17、处，4），用编入目录的微型植株或者植株上获得的薯块来保存转基因株系。4注解1Desiree是最早用于遗传转化的马铃薯品种之一，且仍然作为一种模式品种而被广泛使用。已构建好的转化系统已在众多马铃薯品种中得到成功运用，如“Saturna”和一些野生品种在内的抗性处理植株。2这个方案中生长调节剂母液的准备方法。配制16×250mL的CM培养基（总共4L），应加入0.8mL的NAA母液，0.8mL的GA3母液，10.00mL的玉米素核苷母液，5.12mL经过滤灭菌的水（总共16mL，也就是每250mL CM培养基中加1mL混合好的生长调节剂母液）。将配好的生长调节剂母液分装到1mL无菌离心管

18、中，并置于-20保存，母液可保存6个月。3在这个方案中，所用的抗生素标记为卡那霉素，浓度通常为50-100mg/L。至于潮霉素的浓度，应根据所用马铃薯品种来决定，但要低于卡那霉素的浓度，通常为16-25mg/L。还有一些非抗生素途径也用于马铃薯的遗传转化，如由木糖异构酶介导的半乳糖或者二磷酸尿苷葡糖：半乳糖-1-磷酸尿苷转移酶基因。4大量农杆菌载体被用于马铃薯转化（从Hellens等人能够得到大量的农杆菌载体）。5尽管抗生素抗性系统的工作效率很高，但是根据欧盟规章的规定，这种系统仍应被淘汰，因而应当研究其他的方法。6从茎段长成可用于马铃薯实验的植株，所需的生长周期通常为3-4周。而像S.pju

19、reja 这样的相似品种则需生长6-8周。要想马铃薯外植体能够正常生长，组培瓶良好的透气性也是很有必要的。7. Magenta GA7 vessels、Suncaps（Sigma）或者Vitro Vent Vessels（Duchefa）的透气效果都非常好。若在培养皿中培养时，应用Nescofilm密封，然后在封膜上打开一个30mm的裂缝，并用微孔胶布封上。Fig.2. (A) 在装有堆肥的12.5cm盆中发芽的转基因植株。(B) 移栽6周后的转基因马铃薯株系生长情况。8在许多方案中，农杆菌悬浮液的OD值通常都被忽视。最适宜的OD值应根据方案和生长培养基而有所变化，根据实际证明，数值通常在0.

20、5-0.8之间。9这个转化方法也同样适用于5mm去掉叶柄的叶片部分，以及5mm剪下的叶柄部分。不同的品种，其再生速率也不相同，但茎节部分通常是最容易转化的部分。当然，在操作过程中应小心避免茎节的损伤，所取茎节的宽度通常应小于2.5mm。10一些方案显示，对于我们手中的马铃薯品种，在高激素浓度的培养基中过夜培养外植体将获得很好的效果。这个方法就是在MS20培养基中加上比CM培养基中高10倍的生长调节剂，然后将平板密封，再放到黑暗处过夜培养，温度控制在18-22。接下来就是农杆菌接种和按照本方案中描述的方法操作。11不同报道中的接种方法也不相同。在一些情况下，若要减少共培养的时间，则需使用高浓度的

21、农杆菌进行接种。在研究S.phureja时，由于细菌的过度繁殖，共培养时间已缩减到10分钟。12根据当地的政府规定，不同国家、不同实验室的灭菌方法也不相同。比较适宜的方法通常有高压蒸汽灭菌，漂白剂或者第四代清洁剂处13不同的报道中，共培养的时间也不相同。某些情况下，共培养的时间为24小时，而在其他情况下，时间可能会提升到96小时。但使用上述方法，48小时是最适宜的。在这步中，可以在外植体周围看到淡淡的农杆菌菌圈。为防止农杆菌过度繁殖，将外植体放到90mm培养皿中，加入25mL含有250mg/L的头孢霉素或者羧苄青霉素的MS20培养基，密封好后放在摇床上，50rpm摇60分钟后再接种到平板上。这

22、种方法能够有效缓解这个问题。14注意不要在再生培养基上放过多的外植体。不同的报道，其数量也不同，但对于90mm平板，每个平板上放6到10个外植体是最适宜的。15这个方案与其他方案不同地的地方就在于我们在第二阶段再生培养基中才进行筛选。在一些方案中是直接在共培养后，或者共培养5天后进行筛选。经过大量的实验证明共培养后立即进行筛选是不利的，会降低再生率。16一些抗生素和生长调节剂在光照下会分解，如玉米素等，因此继代培养的时间控制在14天，从而保证筛选能力和抗生素浓度，防止农杆菌过度繁殖。17如果外植体的芽再生率太高，那么就会产生一个潜在的问题，即要确保所选择的芽是一个单独的转基因株系。因此从每个外

23、植体上只选取一个芽就可以有效解决这个问题。然而，有一种可能性就是从外植体上长出的第一批芽不见了，那么就需要一个编目系统（将每个平板、每个外植体以及从每个编号的外植体上获取的芽编号）来确保所选择的芽是一个单独的转基因株系。尽管每个外植体上获取的一些芽能在选择培养基中存活，但是只有一株会用于以后的分析。18成功转基因的表型可以用肉眼很容易分辨出，即从茎段切口处长出的根是直的，但一定要注意不要和不定根弄混。如果没有成功转化，茎段切口处就会在培养基表面产生一定的弯曲。按照我们的方法，经过两轮筛选就能使转化成功率超过95%（用Southern印迹杂交鉴定）。19温室防护等级要根据当地政府的规定以及实验风

24、险来确定。基础的转化实验仅需低等级的防护就可以，而像致病性基因研究或者对环境及人类健康有影响的实验则需要严格的防护措施。20有报道称在后代存在转基因表型变异，这是由于基因随机整合到植物的基因组中造成的。经过仔细研究，我们发现许多植株的表型发生改变，同时在田间实验时大多株系的块茎产量降低。我们将这些改变归因于外植体转化再生阶段中可遗传与不可遗传事件的发生。根据记录，这些非正常表型的发生率通常在15%-80%之间，具体发生率会根据马铃薯品种而发生变化，但这些表型都只在田间试验时出现。很明显，我们要谨慎处理温室试验的原始数据以及从微型植株获得的第一代马铃薯块茎，并将更多的重心放在从块茎发育成完整植株

25、所获得的结果上。感谢感谢苏格兰农村事务部提供SCRI。感谢Susan Mitchell在扩展这些方案时所提供的帮助，以及感谢Laurence Ducreux将这些方案引用到其他物种上。参考文献1. Ooms, G., Bossen, M.E., Burrell, M.M., and Karp,A. (1986) Genetic manipulation in potato with Agrobacterium rhizogenes. Potato Res. 29, 367379.2. Stiekema, W.J., Heidekamp, F., Louwerse, J.D., Verhoeve

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