内生放线菌和寄主植物的抑菌活性及其关系

1、内生放线菌和寄主植物的抑菌活性及其关系 作者：钟莉 田新莉 周敏 王韬 成秋香 陈振华 范云 覃重军【摘要】 从68种中草药植物中分离了560株内生放线菌菌株，其中84株(约占15%)对金葡菌有抑菌活性，36株(约6%)对白念珠菌有抑菌活性，提示中草药植物的内生放线菌可能是抗菌新药的一个来源。检测了9种中草药植物的水或乙醇抽提液对金葡菌的抑菌活性，发现内生放线菌菌株的抑菌活性与其寄主植物没有明显的对应关系。 【关键词】 中草药植物； 内生放线菌； 抑菌活性 ABSTRACT This paper reports that total 84 or 36 out of the tested 560

2、 endophytic actinomycetes strains from 68 Chinese medicinal herbs, showed inhibition activity against Staphylococcus aureus or Candida albicans, respectively, suggesting a potential source for novel antibiotics. Further investigation by using water or ethanol extracts of the nine herbs against Staph

3、ylococcus aureus, indicated no apparent relationships on inhibition of the pathogen between herbs and their endophytic actinomycetes. KEY WORDS Chinese medicinal herbs; Endophytic actinomycetes; Inhibition activity 目前发现的放线菌(主要来自土壤)产生的抗生素和生理活性物质超过10000种，占已发现微生物药物的约2/31。近年来从独特生境中分离放线菌并寻找新的抗生素已逐渐受到重视，如

4、从植物组织内部中分离其内生放线菌和寻找新抗生素2。我国拥有丰富的中草药植物资源，其中一些中草药长期被用来清热解毒、化脓消肿，提示可能存在抗菌活性物质。论文学术科研网本文报道从68种中草药植物中分离大量的内生放线菌，其中约15%菌株具有抗金葡菌的活性，约6%菌株对白念珠菌有抑菌活性。此外，初步探讨了内生放线菌与其寄主植物在抗菌活性方面可能的对应关系。 1 材料与方法 1.1 中草药植物和病原菌来源 本试验所用大部分中草药植物采自上海植物园，丹参和灯盏花采自云南昆明(邱明华研究员提供)，青蒿采自四川酉阳(利民青蒿基地提供)，金葡菌由扬州大学微生物实验室金文杰老师提供。 1.2 培养基、试剂和抗生素

5、 试验中分离内生放线菌所用的为S培养基2、S培养基+重铬酸钾+萘啶酮酸、S培养基+重铬酸钾+萘啶酮酸+链霉素、S培养基+重铬酸钾+萘啶酮酸+万古霉素等4种培养基(重铬酸钾的终浓度为85mol/L，萘啶酮酸65mol/L，链霉素2g/ml，万古霉素4g/ml)，纯化和进一步培养内生放线菌采用高氏一号培养基3。培养金葡菌用LB培养基。 1.3 植物内生放线菌的分离 将采摘的新鲜植物用清水洗净，根、茎、叶各部分分开，于阴凉处风干。用70%的乙醇、0.87%的次氯酸钠和10%的碳酸氢钠分别处理5、20和10min以达到表面消毒，接着用无菌水洗涤三次，再用无菌滤纸吸干水分。将植物剪成约1cm的小段，置于

6、上述4种分离培养基表面，于30培养。样品表面消毒方法参照文献4，5，分离内生放线菌的方法参照文献4，根据形态和培养特征初步鉴定放线菌菌株参照文献3，部分放线菌菌株的鉴定采用16S rDNA序列测定和比对。 1.4 内生放线菌的抑菌试验 金葡菌或白念珠菌接种于25ml LB液体，37培养过夜，取10ml菌液与250ml LB混合，浇制成平板。植物内生放线菌菌株接种于高氏一号培养基，于30生长7d，用打孔器在平板上打孔，接种针挑出放线菌琼脂菌块，放置在混合有指示菌的平板上，30培养23d后观察和测量可能的抑菌圈。 1.5 植物的水或乙醇的提取及提取液的抑菌试验 将采摘的新鲜植物用清水洗净和风干，一

7、份称取0.8g，用研磨碾碎后加入3.2ml 70%乙醇，隔一段时间振荡一次进行萃取；另一份称取0.1g，进行表面消毒(方法同上)，然后剪碎并转移至Eppendorf管，用研磨碾碎后加入0.4ml无菌水浸泡。将灭菌的圆形滤纸片(4mm)置于混合有指示菌的平板上，加入5l水或醇提取液于滤纸片上，30培养23d后进行抑菌圈测定。 2 结果 2.1中草药植物的内生放线菌对金葡菌和白念珠菌的抑菌活性 从上海市植物园、云南昆明和四川酉阳等地采集到68种中草药植物，表面消毒后在4种固体培养基上共分离，并初步鉴定了560株内生放线菌。这些放线菌菌株在高氏一号培养基上经划线纯化培养后打下圆形菌块，置于混合有金葡

8、菌或白念珠菌的平板上以检测可能的抑菌活性。表1结果显示，来自35种中草药植物的84株内生放线菌对金葡菌具有抑菌活性(抑菌圈直径在4.519mm，详细数据未列出)，占测试菌株总数的约15%。来自33种中草药植物(包括白毛夏枯草、腹水草、萱草、大葱、小葱、大蒜、艾蒿、灯盏花、三七、青蒿、移星草、薄荷、三白草、富贵草、九头狮子草、绞股蓝、东风菜、玄参、白英、茜草、马兜铃、博落回、厚果鸡血藤、杜仲、山楂、侧柏、苦参、桑树、雪松、川楝、三尖杉、日本常山云和南旌节花)的167株内生放线菌未检测到明显的抑制金葡菌的活性。 除去分离到较少(如5株)内生放线菌菌株的植物外，分离菌株较多的植物如紫金牛、野荞麦、毛

9、茛和紫菀等的内生放线菌菌株具有抑菌活性的比例较高，分别为56%、50%、50%和41%，提示具有抑制金葡菌活性的植物内生放线菌的分布可能有偏好性。学术科研网 表1结果显示，来自22种中草药植物中的36株放线菌对于白念珠菌具有抑菌活性(约占测试菌株总数的6%)，其中来自贯众、磨芋、败酱和陆英等的内生放线菌菌株具有抑菌活性的比例较高， 分别为21%、表1 43种中草药植物中对金葡菌和白念珠菌有抑菌活性的内生放线菌株数 20%、17%和29%。 2.2 中草药植物的抽提液对金葡菌的抑菌活性 为了进一步研究内生放线菌菌株与其寄主中草药植物在有或无抑菌活性方面是否有对应关系，我们测定了一些植物提取液的抑

10、菌活性。选取内生放线菌菌株具有较高抑菌比例的紫金牛、野荞麦、毛茛、紫菀和贯众等5种植物，以及具有较低抑菌比例的陆英、打破碗花花、括楼和泽兰等4种植物，用水或70%乙醇抽提，检测对金葡菌的抑菌活性。表2结果表明，虽然紫金牛、毛茛、紫菀和贯众等4种植物的水或醇提取物具有抑菌活性，但野荞麦的水或醇提取液中没有检测到抑菌活性；另一方面，虽然括楼的提取液中没有抑菌活性，但是陆英、打破碗花花和泽兰的提取液中却具有抑菌活性。这些结果显示，内生放线菌菌株对金葡菌的抑菌活性与其寄主植物没有明显的对应关系。 3 讨论 由于植物内生菌来自独特的生存环境而成为人们寻找微生物新药的一个重要药源。在植物内生放线菌产生抗生

11、素方面，有报道从杜鹃花6、蛇藤7和卫矛科植物8分离到的内生放线菌产生了新的抗细菌或真菌的化合物。国内文献报道了水稻内生放线菌产生抗真菌的活性9，三叶草中的内生放线菌有抗细菌活性10，西双版纳药用植物中分离的165株内生放线菌中有70株表现抗多种细菌和真菌活性11。在我们的试验中，发现68种中草药植物的560株内生放线菌中表2 9种新鲜中草药植物的抽提液对金葡菌的抑菌活性有84株(约15%)对金葡菌具有抑制活性，有36株放线菌(约6%)对白念珠菌具有抑菌活性，进一步表明中草药植物内生放线菌可能是筛选抗菌新药的一个重要资源。 1993年Stierle等12从短叶红豆杉中发现一种可以产紫杉醇的内生真

12、菌，此后还有许多类似的报道，导致了一种观点：由于植物内生菌与寄主植物的协同进化，内生菌可以产生与寄主植物相同的物质。我们的试验结果表明，至少对抑制金葡菌的活性而言，内生放线菌菌株的抑菌活性与其寄主植物的没有明显的对应关系。一种可能的原因是放线菌属于原核生物，寄主植物为真核生物，两者之间遗传物质的交换特别是基因表达存在很大障碍；而同属于真核生物的内生真菌与寄主植物的遗传物质交流和表达的障碍较小。 致谢：上海植物园草药园，中科院云南植物研究所邱明华研究员，四川酉阳利民青蒿基地，扬州大学微生物实验室金文杰老师。【参考文献】 1 Brdy J. Bioactive microbial metaboli

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