钾离子通道在不同胎龄大鼠动脉导管收缩的作用 论文

1、钾离子通道在不同胎龄大鼠动脉导管收缩的作用钾离子通道在不同胎龄大鼠动脉导管收缩的作用 论论文文关键字：收缩 电流 浓度 细胞 明显 通道 动脉导管 平滑肌 格列本脲【摘要】【摘要】目的目的研究大鼠动脉导管平滑肌中的三磷酸腺苷（ATP）敏感的钾离子通道（KATP）及电压依赖的钾通道（Kv）的发育变化及其在动脉导管收缩中的作用。方法方法通过测量胎龄 19 天（早产）及 21 天（足月）（n=8）胎鼠动脉导管血管环张力及利用全细胞膜片钳技术方法测量动脉导管单个平滑肌细胞的钾离子电流，观察 KATP 激动剂吡拉地尔和 KATP 阻断剂格列本脲，Kv 阻断剂 4-氨基吡啶对动脉导管收缩和钾离子电流的影响

2、。结结果果格列本脲可收缩胎龄 21 天胎鼠的动脉导管，但对 19 天的无作用。钾电流可以因吡拉地尔增加，因格列本脲减少，但这种减少的电流在胎龄 21 天的动脉导管要明显大于 19 天的。4-氨基吡啶在两组作用无明显差异。结论结论本研究数据提示在早产儿与足月儿比较，总的 Kv 电流无明显差异，但 KATP 电流明显减少，KATP 通道未发育成熟，支持 KATP 在动脉导管平滑肌作为一个氧感受器，是早产儿动脉导管未闭发生率高的原因之一。【关键词】【关键词】动脉导管；氧气；钾离子通道；早产儿TheThe rolerole ofof potassiumpotassium channelschannel

3、s inin oxygen-inducedoxygen-induced contractioncontractionofof ductusductus arteriosusarteriosus inin fetalfetal ratrat ofof differentdifferent gestationgestation ageage【AbstractAbstract】ObjectiveObjectiveTo investigated the role of ATPsensitive potassium channel and voltage-dependent potassium chan

4、nelin oxygen-induced contraction of ductus arterioses of rat.MethodsMethodsIsometric force of contact tissue and potassium current insingle smooth muscle cells of ductus arteriosus were measured in twogroups of rats of 19th (premature) and 21st (mature) gestation agerespectively. The effects of pina

5、cidil(KATP activater)，glybenclamide (KATP inhibitor)， and4-aminopyridine(KV inhibitor)were investigated.ResultsResultsglybenclamide contracted ductus arteriesin 21st group but not in 19th group. Potassium current increased byapplying pinacidil in the perfusion solution and decreased byglybenclamide.

6、The change of the currents， together with thedepolarization of the membrane potential were significant greater in21st group then in 19th group. No significant different effect of 4-aminopyridine was observed between two groups.ConclusionConclusionKATP butnot KV channel may be one of the O2 sensors i

7、n ductus arterioses. Itwas underdeveloped in premature fetus. and participate in their poorreaction to oxygen and high incidence of patent ductus arteriosus.【KeyKey wordswords】ductus arteriosus； oxygen； potassiumchannel； premature fetus新生儿的动脉导管通常在生后数小时到数日关闭。出生后随着呼吸的开始，血氧分压升高是动脉导管收缩的重要原因。早产儿动脉导管对氧浓度变

8、化的反应欠佳，与早产儿动脉导管对氧的敏感性尚未成熟有关。提高灌流液氧分压可引起离体动脉导管收缩。这种氧气引发的动脉导管收缩的机制尚不明确。氧气诱导血管内皮释放内皮素是使动脉导管收缩的原因之一1。Roulet 和Coburn2发现血氧分压升高可引起细胞膜去极化。研究发现 ATP 依赖的钾通道（ATP-dependent K channel，KATP，）阻断剂格列本脲，可收缩动脉导管；而 KATP 开放剂克罗卡林，可以拮抗氧气引发的动脉导管收缩3。因此，笔者推测富氧可以关闭 KATP，从而使平滑肌细胞膜去极化。但是 Tristani-Firouzi 等4发现在动脉导管也存在着电压依赖的钾通道（vo

9、ltage-dependent K channel，Kv），并在富氧的条件下关闭，因此他们认为动脉导管上的氧感受器是 Kv。KATP 和 Kv 在动脉导管收缩中的作用仍然没有定论。在我们以前的实验中发现，氧气引发的动脉导管收缩现象只在胎龄 21 天的胎鼠动脉导管出现，而在 19 天的不能引出5。在动脉导管中作为氧感受器的通道，在早产儿应该尚未发育成熟。因此，本研究的目的是了解胎鼠动脉导管平滑肌中 KATP 和 Kv 发育情况及它们在动脉导管收缩中的作用，以探明动脉导管的收缩机制。1 1对象与方法对象与方法1.11.1对象未生育过的 Wister 鼠，过夜交配后若在阴道拭子发现有精子则初步判断受

10、孕并定为胎龄第 0 天（足月 21.5 天）。胎龄 19 或 21 天时用苯巴比妥(50 mg/kg)腹腔麻醉母鼠后剖腹取胎鼠。整个过程遵循美国生理协会的相应规则。所有试剂及药品均来自美国 Sigma 公司。1.1.11.1.1测量张力使用完整动脉导管环分离出胎鼠的纵隔组织并置于 HEPES 缓冲液中。HEPES 液成分(mM)：NaCl， 142； KCl， 5； CaCl2，1.5； glucose，6； MgCl2， 1； HEPES， 5； 用 NaOH 滴定到 pH 7.4，再用100%氮气(N2)平衡。在解剖显微镜下从胸腔取出动脉导管，制备成 0.40.6mm长的血管环段，然后放于

11、 37的浴槽。1.1.21.1.2电生理实验使用新鲜分离的单个平滑肌细胞所有用于制备和保存单个动脉导管平滑肌细胞的液体均以 100%N2 平衡。动脉导管和肺动脉从胸腔取出后放置于去钙的 Hanks 溶液。Hanks 液成分(mM)：NaCl 138.8， KCl5.4， NaH2PO4 1.2， MgCl2 0.5， HEPES 10， EGTA 0.1， 用 1M NaOH 滴定到 pH 7.4。然后把血管剪成小片、置于没有 EGTA 的 Hanks消化液，其中含有木瓜蛋白酶 0.4mg/ml， 二硫苏糖醇 0.19mg/ml， 以及牛血清白蛋白0.2mg/ml；在 37水箱中消化 58mi

12、n，再置于没有 EGTA、含有胶原酶0.25mg/ml 的 Hanks液，37消化 57min。再把胶冻样的组织用毛细吸管移至加有 10 mg/ml 葡萄糖的普通 Hanks液并保存在冰中，实验开始前轻轻搅动即可获得单个细胞。1.21.2方法1.2.11.2.1血管张力测量按照常用的等容收缩方法测量血管张力。用两根直径 25m 的钨丝穿过血管腔，通过压力传感器(Leonia 公司 Kulite 半导体)接到肌动描记器，并记录等容收缩的张力。实验开始后，用 Krebs-Henseleit（K-H）液以 10 ml/min 的速度灌洗。K-H 液成分（mM）： NaCl，118； KCl， 5；

13、CaCl2， 1.5； glucose，6； MgCl2， 1； NaHCO3， 24；NaH2PO4， 0.436，用 95%N25%CO2 气体平衡，使浴槽中灌洗液 pH 值为7.387.42；氧分压 2225mmHg；二氧化碳分压 3542mmHg。在使用高钾溶液(钾浓度 50 mM)时，用等摩尔的 KCl 替代 NaCl。记录血管轴长，两条钨丝之间的距离及牵拉开始时的牵引力。以牵引力(mN)除以血管轴长（mm）表示血管壁张力（mN/mm）。对 19 和 21 天胎龄的标本，调节其基础张力分别到 0.30.5mN/mm (平均 0.40.1)和 0.60.8mN/mm(平均 0.70.1

14、)。采用 3 种方法使动脉导管环收缩：4M 格列本脲（KATP 通道阻断剂）；10mM 4-氨基吡啶（4-AP）（Kv 阻断剂）；以及 50mM KCl。格列本脲和4-AP 均溶解在 K-H 液中。1.2.21.2.2膜片钳实验低氧液以 6ml/min 的速度灌洗，组织池中的氧分压由血气机（Ciba Corning 280）测定，间隔 5min 采样，连续 3 次保持在3035mmHg 时开始实验。细胞放置于操作池中，选择纺锤状、表面光滑、折光性好的平滑肌细胞。电极内液成分(mM)：KCl 20， KOH 120， MgCl2 2， EGTA10， HEPES 5， Mg-ATP 1 或 5，

15、 aspartate 60 (pH 7.4)。灌流液成分(mM)：NaCl 143， KCl 5.4， NaH2PO4 0.33， MgCl2 0.5， HEPES 5， NaOH 调节 pH到 7.4。灌流液用 100%氮气平衡。利用二甲亚砜溶解 KATP 激动剂吡拉地尔和KATP 通道阻断剂格列本脲，并使后二者在灌流液中的浓度分别为 110M 和4M。灌流液中二甲亚砜的浓度不超过 0.2%。电极后尖端阻抗为 56M。调整微推进器，完成 G封闭后，副压吸引形成全细胞结构。利用 Axopatch 200B 放大器，由 pClamp8.2 发放刺激脉冲，采样频率为 10kHz，低通滤波频率为 2

16、kHz，记录静息膜电位及电流。刺激方案为：保持电位在-70 mV 使钾电流失活，从-80mV 到+60 mV 范围，阶跃10mV， 刺激频率 0.1 Hz。电流密度表示为电流与细胞膜容积之比，单位pA/pF。被吡拉地尔激活并被格列本脲抑制的电流即是 KATP 电流。1.31.3统计学方法在 Stateview 及 Clamfit 分析软件下处理结果。取电流时程的最后 400ms 数据进行测量。结果用平均值标准差表示。未配对的两组均值比较采用 t 检验。对药物反应的统计学比较采用配对 t-检验和分析变量的重复测定。P0.05）；在两组均可观察到 4-AP 引起的血管收缩（P0.05）；只在 21

17、 天组可见由格列本脲引起的动脉导管收缩(P100M)吡拉地尔也会激活 KCa通道8，故在用吡拉地尔之前常规加入 1 mMTEAC 以减少误差。在 21 天组，由 10 M 吡拉地尔激活的钾电流比 19 天组明显增多。在两组中均发现 10 M 吡拉地尔激活的钾电流最大，浓度继续升高并没有同期增多的电流。被格列本脲阻断的钾电流大小与被 10 M 吡拉地尔激活的钾电流大小相等。这种电流在 21 天组明显大于 19 天组。当使用 1 M ATP 作为电极液时，4 M 格列本脲可明显抑制钾电流， 提示在这种条件下 KATP 是开放的。而且这种电流在 21 天组明显大于 19天组（P0.05）。吡拉地尔可

18、激活钾通道，而且这些被激活的电流可以被格列本脲阻断，阻断的电流比激活的稍大，也表明在基础条件下，有部分 KATP 是开放的。这种被阻断的钾离子电流在足月组也明显高于早产组。两组的膜电位没有差别(足月组-40.73.3 mV，早产组-41.54.0mV)。格列本脲可明显改变单个细胞膜电位，并且在两组间有明显差异(足月组33.33.3 mV，早产组 8.22.8 mV，P0.01)。3 3讨论讨论细胞内 ATP 浓度低时 KATP 通道开放9，这时给予格列本脲可以使之关闭。如果有较多的 KATP 通道被关闭，可以导致细胞膜的去极化，从而开放电压依赖的钙通道，增加细胞内钙浓度，使血管平滑肌收缩。有报

19、道格列本脲可以收缩足月新生兔的动脉导管3。本实验中，格列本脲也可使足月大鼠的动脉导管发生明显收缩。这些数据提示在低氧环境，成熟胎鼠动脉导管 KATP是开放并且有功能的。但在未成熟胎鼠却看不到这种格列本脲引起的动脉导管收缩现象，提示在未成熟胎儿动脉导管的 KATP 是无功能或者是未发育完善的。在我们以前的实验中证实了氧气可以使胎龄 21 天的大鼠动脉导管收缩但对19 天的无效；而且未成熟胎儿的血管收缩系统，包括平滑肌细胞膜的去极化、细胞内钙浓度的增加以及细胞内钙活化收缩蛋白等与成熟胎儿比较没有明显差别，但对血氧变化的感应机制不成熟5。这些结果支持 KATP 是动脉导管的氧感受器之一。因为 4-A

20、P 引起的收缩在两组无明显差别，提示在早产鼠动脉导管的总的 Kv 通道与成熟鼠没有区别。当然，因为 Kv 通道有很多亚类， 在未成熟胎儿的动脉导管也可能存在某些 KV 亚类发育不完善，尚不能完全排除 KV 也是动脉导管的氧感受器之一。KATP 通道的活性与细胞内三磷酸腺苷（ATP）， 二磷酸腺苷(ADP)和其他二磷酸核苷的浓度及比例有关10。在缺氧时血管平滑肌组织 ATP 浓度是否降低仍无定论。以前的实验显示，在动脉导管组织，当灌流液从低氧改到富氧状态后，由 340nm 激发的自发荧光强度虽然降低得不多但具有统计学意义3。提示荧光底物（如吡啶核苷酸）浓度在低氧环境中因为无氧代谢而有所增加。Sh

21、igemori11提出低氧环境可以明显降低门静脉和肺动脉中的 ATP 浓度；但 Leach 等6在报告中指出， 在静息状态且没有受到牵拉的动脉，低氧并不会明显降低其组织 ATP 浓度。在生理状态下，血管平滑肌细胞内的 ATP浓度为 1.5 4mM6，7。在本研究中，笔者选择了两种 ATP 浓度作为吸液管内液：1mM 和 5mM。在吸液管内液 ATP 浓度为 1mM 时，格列本脲可以明显阻断钾电流，而在 5mM 组则未见此现象。这表明 KATP 通道在 1 mM ATP 这表明KATP 通道在 1 mM ATP 环境中是开放的，而在 5 mM ATP 环境中是被抑制的。有报道当 ATP 浓度在

22、10200M 时，血管平滑肌细胞的 KATP 电流可以有一半被阻断10。本研究也发现在动脉导管平滑肌细胞，较高浓度 ATP 可以阻断其 KATP 电流。在缺氧状态时的 ATP 浓度改变，可以改变 KATP 通道的活性，从而使动脉导管扩张。但是不同部位血管组织的 KATP 通道对 ATP 的敏感性可能是不同的10。本研究中，被吡拉地尔激活、格列本脲阻断的钾离子电流在足月组明显大于早产组。表明在早产组动脉导管平滑肌细胞膜上的 KATP 通道尚未发育成熟。有人可能会认为在早产组 KATP 通道也是存在的，只是被 1 mM 的 ATP 所抑制了；但实际上吡拉地尔在 3 mM ATP 的条件下仍然可以激

23、活 KATP 电流10，12，13。胎鼠动脉导管平滑肌细胞膜电位与文献报道值近似2。与张力实验结果一致，由格列本脲引起的膜电位的降低在足月组明显大于早产组。有报道在完整动脉导管，去极化到 15 mV 可以引起最大收缩的 25%的收缩，去极化到21 mV 则引起完全收缩。虽然格列本脲对单个细胞膜电位的影响与整体组织的可能有差异，我们的研究也提示了格列本脲引起的去极化在早产组没有足月组明显。总之，本研究结果表明：在未成熟胎儿的动脉导管平滑肌细胞膜上的ATP 依赖的钾离子通道是未发育完善的。本研究结果支持 ATP 依赖的钾离子通道是动脉导管平滑肌细胞膜上的血氧感受器之一的假设。也支持在早产儿 KAT

24、P的发育不成熟是在其动脉导管观察不到氧诱发的收缩现象的原因之一的假设。【参考文献】【参考文献】1Jing S， Nakanishi T， Gu H， et al. The Role ofEndothelin in Oxygen-induced Contractionof the Ductus Arteriosusin the Rabbit and Rat Fetuses. Heart Vessles，2002， 16：181-188.2Roulet MJ， Coburn RF. Oxygen-induced contraction in theguinea pig neonatal ductu

25、s arteriosus. Circ Res，1981， 49：997-1002.3Nakanishi T， Gu H， Hagiwara N， et al. Mechanisms ofoxygen-induced contraction of ductus arteriosus isolated from thefetal rabbit. Circ Res，1993， 72：1218-1228.4Tristani-Firouzi M， Reeve HL， Tolarova S， et al.Oxygen-induced constriction of rabbit ductus arteri

26、osus occurs viainhibition of a4-aminopyridine， voltage-sensitive potassiumchannel. J Clin Invest，1996， 98： 1959-1965.5Wu G， Jing S， Momma L， et al. The effect of vitamin Aon contraction of the ductus artreriosus in fetal rat. Pediatr Res，2001，49：747-754.6Leach RM， Sheehan DW， Chacko VP， et al. Effec

27、ts ofhypoxia on energy state and pH in resting pulmonary and femoralarterial smooth muscles. Am J Physiol，1998， 275： L1051-L1060.7Post JM， Jones AW. Stimulation of arterial 42K efflux byATP depletion and cromakalim is antagonized by glyburide. Am JPhysiol，1991， 260： H848-H854.8Bychkov R， Gollasch M， Ried C， et al. Effects ofpinacidil on K channels in human coronary artery v