鲤鱼脑乙酰胆碱脂酶的活性测定

1、 北京科技大学必修课程实验研究论文题目:课程:班级:作者:学号:鲤鱼脑乙酰胆碱脂酶的活性测定生物化学实验黄凯辉41467024化生学院生技1401鲤鱼脑乙酰胆碱酯酶(AChE的活性测定黄凯辉摘要 建立了以新鲜猪心为材料,经过酸溶液提取,人造沸石吸附,硫酸铵溶液洗脱和三氯乙酸沉淀等步骤快速制备细胞色素C的方法,进而考察了制备蛋白质制品的一般原理和操作技术。测定细胞色素C 含量时,其520nm处吸光度的标准曲线为:y = 0.7762x + 0.05,R² = 0.9974;将细胞色素C粗品溶液稀释适当倍数,加入少许联二亚硫酸钠后,在520nm下测其吸光度A=0.210。样品原液浓度C=

2、1.072 mg/mL;每500g心肌碎肉含细胞色素C=64.0 mg。关键词 细胞色素C 分离纯化分光光度法1 引言经系统疾病、肝脏系统疾病、重症肌无力、有机磷中毒等的重AChE可溶于水或稀盐溶液,因而可将生物组织及缓冲溶液置于组织匀浆器或组织捣碎机中制备组织匀浆,经离心后,其上清部分可用于测定组织中AChE的活性。AChE的活性定方法主要有光学方法和电化学方法。本实验采用分光光度法测定AChE活性。其基本原是乙酰胆碱酯酶催化碘化硫代乙酰胆碱水解,其生成物碘化硫代胆碱与巯基显色剂5,5-二硫代-双(2-硝基苯甲酸(DTNB反应,生成黄色产物5-巯基-2-硝基苯甲酸(5-TNBA,反应方程式如

3、下图所示。本实验通过测定酶促反应初速度的方法计算酶活性。方法是酶促反应开始后每30s测定次吸光度,连续测定3min。计算吸光度变化的平均值A/min。根据波尔定律:A=CL,每分钟产物浓度的变化值C=A/L。已知5-TNBA的值为1.96×105 L/molcm,比色杯的光程长1 cm,因此,C(mol/L =A/(1.96×105。根据酶活性单位的定义:25 ,最适pH值和最适底物浓度下,酶分钟催化1mol底物所需的酶量为1 IU,酶活性=C×106 IU。酶的比活=酶活性/总蛋白浓度。2 实验部分2.1 试剂和仪器活鲤鱼。硫代-双(2-硝基苯甲酸5 mmol/

4、L 碘化硫代乙酰胆碱100 mmol/L5,5-二Tris-HCl缓冲溶液(pH7.4,20mmol/L,含0.1% Triton X-100和0.05mol/L NaCl磷酸盐缓冲液(pH7.4,20mmol/L考马斯亮蓝G-250试剂冷冻高速离心机,分光光度计,组织匀浆器。2. 2 乙酰胆碱脂酶的制备取1条活鲤鱼,剪开头骨,再用镊子将整个脑组织取出,以滤纸吸去血丝,并除去非脑组织,放入表面皿中称重。然后用含0.1% Triton X-100和0.05mol/L NaCl的Tris-HCl缓冲溶液(pH7.4,20mmol/L 冰浴条件下匀浆,匀浆比(质量体积比为1:4制成匀浆液。在4 离心

5、(10000r/min30min,得离心上清液,即为粗酶提取液,记录体积并在4下保存。参照Bradford(1976考马斯亮蓝G-250法。用牛血清白蛋白(BSA作为标准,绘制标准曲线。取1ml待测酶液(调整蛋白质含量20-100g,加5ml考马斯亮蓝G-250染色液,混合均匀后30min 内测OD值。由标准曲线计算酶液中蛋白质的含量。取3m1磷酸缓冲溶液和50l酶提取液加入10ml试管内,于35保温10min。依次加入20l碘化硫代乙酰胆碱(100mmol/L,20l DTNB溶液(5mmol/L,混合均匀。在波长412nm处用1cm比色皿比色。测定时每隔30s读数,连续测定3min。3 数

6、据记录3.1标准溶液的配置标准蛋白溶液的配制:精确称取牛血清白蛋白500mg,用蒸馏水定容至50mL,配成10.mg/mol的溶液1。取1ml溶液1,用去离子水定容至10ml,配成1.00mg/ml的标准蛋白溶液。考马斯亮蓝G-250溶液的配制:精确称取考马斯亮蓝G-250100mg,溶于50mL95%的乙醇,再加入120mL85%的磷酸,稀释定容至1000mL备用。3.2 未知样品中蛋白质吸光度值的测定实验中加入50ul碘化硫代乙酰胆碱,以确保使乙酰胆碱脂酶一直能发挥最大酶活,在各个时间点读数如下:时间点0S30S60S90S120S150S180S3.3标准曲线的确定在试管中分别精确移取牛

7、血清蛋白标准溶液0、70、80、90、100、110、120uL,加蒸馏水至1.0mL,然后在各支试管中分别加入4.0mL考马斯亮蓝G-250溶液,摇匀。 在595nm波长处测定吸光度 4数据处理4.1标准曲线的建立以牛血清白蛋白标准溶液浓度为横坐标,以吸光度为纵坐标,绘制标准曲线。 回归方程为Y=30.779X- 0.0094 (R2=0.9989。4.2酶活测定建立吸光度-时间曲线 回归方程为y=0.001564x+0.0355 (R2=0.99944.3酶活计算由吸光度-时间曲线可知每秒吸光度变化0.001564,由蛋白质浓度-吸光度标准曲线可知,每秒蛋白质浓度增加3.562x104结论:本实验测得鱼脑中乙酰胆碱脂酶活为3.562x1045.注意事项1 实验材料应尽