PCR仪常见问题及回答

1、PCR仪常见问题及回答1. cDNA产量的很低可能的原因：* RN模板质量低*对mRN浓度估计过高*反应体系中存在反转录酶抑制剂或反转录酶量不足*同位素磷 32过期*反应体积过大，不应超过50 12. 扩增产物在电泳分析时没有条带或条带很浅*最常见的原因在于您的反应体系是PCR勺反应体系而不是RT-PCR勺反应体系*与反应起始时RN的总量及纯度有关*建议在试验中加入对照 RNA*第一链的反应产物在进行PC扩增时，在总的反应体系中的含量不要超过 1/10 *建议用Oligo(dT)或随机引物代替基因特异性引物(GSP)用于第一链合成。由于 RNAI板存在二级结构，如环状结果，有可能导致GS无法与

2、模板退火；或SSU反 转录酶无法从此引物进行有效延伸。a.b.目的mRN中含有强的转录中止位点，可以试用以下方法解决： 将第一链的反应温度提高至50C。使用随机六聚体代替 Oligo(dT) 进行第一链反应。3.*产生非特异性条带用RT阴性对照检测是否被基因组DN污染。如果RT阴性对照的PCR吉果也显示同 样条带，则需要用DNase I重新处理样品。*在PC反应中，非特异的起始扩增将导致产生非特异性结果。在低于引物Tm 2至5C的温度下进行退火，降低镁离子或是目的DNA勺量将减少非特异性结果的产 生。*由于mRN剪切方式的不同，根据选择引物的不同将导致产生不同的 RT-PC结果。4. 产生弥散

3、 (smear) 条带*在PC反应体系中第一链产物的含量过高*减少引物的用量*优化PC反应条件/减少PCR勺循环次数*在用DNases理被DN污染的RN/样品时，其产生的寡核苷酸片段会产生非特异 性扩增，一般会显示为弥散背景。5. 产生大分子量的弥散条带 大多数情况下是由于退火温度过低而导致的非特异性的起始及延伸产生的*对于长片段的PCR建议将反应体系中cDNA勺浓度稀释至1:10(或1:100-1:200)6. 在无反转录酶的情况下，对照RN获得扩增结果*通常是由于对照RNA中含有痕量DNAS导致的。由于进行体外转录时不可能将所 有的DNA模板消除。建议可将第一链cDN稀释1:10、1:10

4、0、1:1000倍以消除DNA 污染所造成的影响。有可能是引物二聚体的条带7. 扩增产物滞留在加样孔中*有可能是由于模板量过高而导致PCR吉果产生了高分子量的DN胶状物。建议将 第一链结果至少稀释 100倍再进行二次扩增。Tms低5C,可以将退火温度*另外，在二次PC时使用的退火温度如果比引物的 适当增高或进行热启动以提高特异性。8. SS m与SSU有何不同？*具有更高的热稳定性(达50 C) *具有更长的半衰期 (达220分钟) *对PC无抑希y*干冰运输？SSE则更稳定。* Tdt活性更低9. 为什么有人更喜欢用SSM而不是ThermoScriptThermoScript 如果保存不当会

5、引起活性很快降低,10. 为什么使用基因特异性引物 (GSP)？GS在扩增低丰度的转录本时是最好的。OligodT引物建议用于高质量RNAi全长 转录本的逆转录；随机引物用于mRN片段的逆转录。11. 什么情况下需要使用 RNase H？在第一轮PC中RNA/DN杂合体不能正常变性时12. 根据不同的目的选择不同的系统：目的建议RT与 PC使用不同的引物或需要灵活选择PCR DN聚合酶两步法RT-PC系统高灵敏度一步法或两步法RT-PC系统高特异性含有适当的DNAg合酶的两步法RT-PC系统 或具有高保真Plat in um Taq酶的一步法RT-PC系统 高保真度含有Pfx Taq酶的两步法

6、RT-PC系统长的反转录结果通常使用两步法RT- PC系统可达到最佳结果 含Elongase酶的一步法RT-PC系统 二、 Generacer1. 如何针对Gen eracer试剂盒设计基因特异性引物(GS P)?使用5或3'AC试剂都需要至少一条基因特异性引物，您在设计引物时需要注意 以下几点要求：* 50-70 %的G(含量，以提高引物熔点(Tm)* 23-28个碱基长度，以提高引物特异性*降低3端G(含量，将引物非特异性结合的可能性降至最低2. 为什么得不到RACE?物？*加入Hela对照*低质量的rnAI板*逆转录失败，SSII和SSIII非常适用于长模板cDNA勺合成*目的基

7、因丰度太低，可以通过提高 PCR勺循环次数来解决，建议使用巢式 PCR *目的基因没有表达，可以通过使用两条 GSP来分析cDNZ中是否含有目的基因*目的基因太长而不适合进行反转录，建议使用 Gen eRace试剂盒中的Oligo dT 来得到全长cDNA使用随机引物或与模板的5端尽可能近的GS进行PCR* cDNAg板属于困难模板，可以通过以下方法解决：优化 PC反应参数及反应体 系；降低退火温度；使用5-10 %的DMS帮助通过高G（含量区；使用高保真度和高 延伸能力的酶进行PC反应。3. RACE的PCR吉果有杂带RACE PC杂带或非特异性PC条带可能是由于以下原因：* GS与其他cD

8、NA勺非特异性结合会导致在扩增目的产物时得到无关产物。* Gen eRace引物和cDNA勺非特异性结合会导致产生一端带有 Gen eRace引物序 列的PC产物。* RN降解。* PCRf或试剂污染。注意：杂带一般是因为没有优化PC条件，可以加入阴性对照来确定。4. 得不到全长的5'ACE PC产物* CIP反应后的RNAt解产生了新的带有5磷酸的断裂模板，可以同GeneRacerRNA Oligo连接。一定要小心操作，保证RNAc降解。* CIP脱磷酸不完全，可以增加反应中CIP的量或减少RNA勺量。* PC产生了杂带，并不是真正的连接产物，可以使用上述建议优化PCR三、PCR在进行PC时：*请确保您没有使用过量的起始 DNAE者过高浓度的引物，也没有加入过量的Mg+*请确保您使用了恰当的退火温度*请确保您没有使用过量的DNA聚合酶 四、引物1. 应该选择哪种纯化方法？ 取决于实验目的和引物的长度2. 为什么我订购了 50nmol,但是收到却只有40nmol?50 nmol是起始量3. 怎样制备100 uM的储液？体积（卩I）质检报告上的nmol数目X 104. 怎样设计引物？一般长度 20-30bp；*至少50%勺G（含量；*避免引物二聚体和二级结构；