鸡传染性支气管炎病毒分子生物学研究进展_宋显章

1、鸡传染性支气管炎病毒分子生物学研究进展宋显章,韩青松,涂宜强,涂国众(温州科技职业学院动物科学系动物科学研究所,浙江温州325006摘要:鸡传染性支气管炎病毒(infectious bronchitis virus ,IBV 主要侵害鸡的呼吸系统和泌尿生殖系统,可以引起鸡的呼吸道症状、肾脏损害、产蛋量和蛋的品质下降。该病毒血清型较多,容易产生变异,给疫病防控带来很大困难。主要对近年来在IBV 的基因组结构、IBV 的复制过程、IBV 的结构蛋白及生物学功能、IBV 的变异机制、IBV 的进化以及IBV 的鉴定和检测等方面的研究进展进行综述,以期为更加深入地认识和研究该病毒提供参考。关键词:鸡传

2、染性支气管炎病毒(IBV ;分子生物学;研究进展中图分类号:S852.657文献标识码:A 文章顺序编号:1672-5190(201101-0071-03Research Progress in Molecular Biology of Avian Infectious Bronchitis VirusSONG Xian-zhang,HAN Qing-song,TU Yi-qiang,TU Guo-zhong(Institute of Animal Science ,Animal Science Department,Wenzhou Vocational College of Science

3、and Technology,Wenzhou 325006,China Abstract :Infectious bronchitis virus (IBVmainly invade chicken respiratory system and urogenital system and cause respiratorysymptoms,kidney damage,egg drop and egg quality decline.IBV have many serotypes and are more prone to mutation,which causes great difficul

4、ties in its prevention and control.The paper mainly reviews genomic structure,replication process,structural proteins and biological function,mutation mechanism,evolution,identification and detection of IBV in order to provide reference for more in-depth understanding and research about IBV.Key word

5、s :avian infectious bronchitis virus (IBV;molecular biology;research progress 鸡传染性支气管炎(infectious bronchitis ,IB 是一种急性、高度接触性传染病,是危害养禽业的重要疾病,该病的发生常给养禽业带来一定的经济损失。IB 的病原体为传染性支气管炎病毒(infectious bronchitis virus ,IBV ,是冠状病毒科(Coronavirindae 冠状病毒属(Coronavirus 成员。1IBV 基因组结构IBV 是冠状病毒科冠状病毒属的代表种,基因组为不分节段的单股正链RN

6、A ,长约27.6kb ,有5帽子和3尾巴结构,可转录出6种亚基因组mRNAs (16。所有mRNA 都具有共同的3末端嵌套式结构,一个64核苷酸的前导序列1。其中mRNA 2、mRNA 4、mRNA 6分别编码IBV 的3种结构蛋白,即纤突蛋白(spike ,S 、膜蛋白(membrane ,M 、核衣壳蛋白(nucleocapsid ,N ,其余mRNA 编码一些功能尚不十分清楚的小分子蛋白。IBV 的基因定位顺序为5Cap-1a-1b-S-3a-3b-E-M-5a-5b-N-3Poly A 2。2IBV 的复制过程S 蛋白对IBV 侵染性起着重要作用,S 蛋白在近酸性的环境下介导病毒与细

7、胞膜融合,释放病毒核酸进入宿主细胞内进行复制。粗面内质网是病毒蛋白合成的场所,由于M 蛋白跨膜区疏水结构无法使其通过网状结构,病毒装配只能从内质网开始。病毒在由内质网到高尔基体的过程中获得双层质膜。S 蛋白的聚集部位是粗面内质网与高尔基体之间的通道,该部位也可能是病毒出芽的地方,3种蛋白的糖基化均在高尔基体内完成。加工成熟的子代病毒粒子在高尔基体内包含在光滑的囊泡内,迁移至细胞表面释放。IBV 的复制可能还与宿主细胞的核转录系统有关。S 蛋白上存在着进入高尔基体的滞留信号,当S 蛋白装配入病毒后,这些滞留信号被掩盖,进入高尔基体转运大大加快。Li 等人研究发现3,在培养的H1299细胞和Ver

8、o 细胞,感染IBV 病毒对细胞能产生生长抑制作用,从而诱导培养收稿日期:2011-01-15作者简介:宋显章(1976,男,畜牧师,硕士,主要研究方向为畜牧业管理及发展策划。通讯作者:涂国众(1963,男,高级兽医师,主要从事牧场规划设计、畜禽疾病防控以及畜牧场的饲养管理工作 。图1IBV 基因组结构模式图Animal Husbandry and Feed Science 畜牧与饲料科学2011,32(1:71-73的细胞停留在细胞周期的S、G2或M期。他们的研究表明,细胞周期停留在S、G2或M期受病毒复制增强的调控。此外,在培养细胞感染周期的后期阶段,IBV诱导的细胞凋亡和p53蛋白无关。

9、得出这个结论是因为他们发现细胞凋亡可以在H1299细胞和Vero细胞中发生,并且IBV感染不会影响p53蛋白在宿主细胞中表达。3IBV的结构蛋白及生物学功能3.1S蛋白S蛋白是决定IBV抗原性的主要蛋白,构成了冠状病毒的最表层纤状突起,是IBV最重要的保护性抗原。S基因表达产物S蛋白N-末端在跨越内基质网内膜时被切除10个疏水氨基酸构成的信号肽,并被裂解为90ku 和84ku的2个亚单位S1和S24。S1在最外层形成一个蘑菇状的突起,S1基因的核酸序列有一个突变区。Callison等人用DNA Shuffling的方法,从代表4种不同血清型的IBV 重组过程中得到新的S1基因型5。他们得到的重

10、组体是一种新的、包括一个全长的开放阅读框。在他们的研究中,没有一个重组体包括4种所有的母源基因,并且没有一个重组体含有亲缘关系较远的Delaware072株的基因。他们的试验表明,亲缘关系较远的病毒株之间的重组可能性较小。S蛋白是IBV的主要病原性和保护性蛋白,其作用表现为刺激机体产生特异性中和抗体、血凝抑制抗体以及迟发型超敏反应,在病毒吸附细胞过程中发挥重要作用,在血清学分类上起决定性作用。3.2N蛋白N蛋白占病毒蛋白总量的40%,是一种由409个氨基酸残基组成的磷酸化蛋白,不能被糖基化,氨基酸推导序列分析发现,其中17%为碱性氨基酸,且80%的碱性氨基酸在位置上是保守的,通常簇集在66aa

11、88aa、181 aa234aa、334aa373aa3个区域。N蛋白3个碱性氨基酸区域的基本特征可能有利于其与病毒核酸的结合,以便包裹核酸,使病毒基因组RNA易于装配入病毒粒子内部。Fan等6获得了一个稳定的N蛋白N-末端(IBV-N29-160氨基酸残基片段(这一区域类似于SARS-CoV的一个RNA 结合区域,并得到其晶体结构,对其晶体结构分析表明,该蛋白核心由5条反向平行的片层伴有一带正电的发夹结构和一个疏水性的平面构成,并推断这一核心结构很有可能参与结合病毒RNA。N蛋白是重要的免疫原,在刺激机体的细胞免疫和体液免疫中起重要作用。目前,在N蛋白上已经定位了3个IBV特异性B细胞识别表

12、位,分别位于175aa241aa、310 aa370aa和360aa409aa区域。虽然S蛋白、M蛋白和N 蛋白均能诱导ELISA可检测的反应抗体,但N蛋白所诱导的ELISA抗体出现最早,效价也最高,这说明N蛋白上有更多的交叉反应表位,或者说N蛋白具有更高的免疫原性。Ignjatovic等7进行多肽筛选,鉴定出N蛋白72aa86aa位上有一个抗原表位,并能诱导迟发性超敏反应。细胞免疫反应对于鸡抵抗IBV的攻击非常重要,特别是鸡群从感染到康复的过程,更需要细胞毒性T细胞对病毒感染细胞进行杀伤。3.3M蛋白M蛋白是一种跨膜蛋白,它是IBV粒子中含量最多的糖蛋白,M蛋白由mRNA4所编码。M蛋白端位

13、于病毒离子外部并被糖基化,其主要组成部分跨膜3次,M蛋白横跨囊膜,大部分在囊膜的内侧面,仅有一小部分糖基化的N端露在膜外,M蛋白的N端有2个糖基化位点。M蛋白具有控制并介导病毒粒子从粗面内质网膜或高尔基体膜出芽,在病毒装配时与核衣壳相互作用,并将核衣壳结合到囊膜上的作用。对M蛋白的研究还发现,与核衣壳蛋白和纤突蛋白相比,其免疫原性最低8。然而,也有报道认为,M 蛋白上存在着重要免疫原性的抗原决定簇,但其免疫生物学功能,尤其是该蛋白在病毒致病过程中的作用及其与病毒的组织嗜性的关系还需要进一步研究。4IBV的变异机制与所有的冠状病毒一样,IBV的核酸具有很高的基因突变及RNA-RNA重组率,这就是

14、IBV不断有新的血清型和变异毒株出现的主要原因。4.1基因突变目前,研究结果表明,IBV的S蛋白、N蛋白、M蛋白在病毒的进化上均表现出变异现象,其中又以S 蛋白的变异最为明显。有研究表明,S蛋白的50170位和250310位的氨基酸残基发生替代的概率较大,而120170位氨基酸残基更常见插入或缺失9。Xu等对20032004年在鸡群分离得到的4株IBV病毒的研究发现,S1的核苷酸和氨基酸的相似性在88.98%99.28%之间10。一般认为,冠状病毒的N蛋白是高度保守的,同一种病毒的不同毒株间的同源性达90%以上,有报道证实,IBV的N基因也有较大的变异性,尽管这些变异不会影响N基因和3端非翻译

15、区的核苷酸序列。Park等人在韩国分离了20012003年的IBV病毒11,他们用RT-PCR的方法克隆了N基因,并且对其进行测序以及同已经发表的不是韩国的N基因序列和氨基酸序列进行了比较。韩国的IBV分离株之间有89.2% 98.3%的相似性,韩国分离株和非韩国分离株的氨基酸相似性在57.0%96.6%之间。Bing等人对我国不同省的5株不同IBV的S1蛋白进行了基因和进化分析的研究12,发现5株IBV的核苷酸和氨基酸的同源性分别是76.7%92.1%和73.9%89.5%,这表明不同分离株的S1基因有很大变异。他们认为S1蛋白基因的点突变、插入和删除在很多地方都能见到,尤其是在S1蛋白N-

16、末端的前150个氨基酸。他们观察到,5株IBV都有2种基序切割位点(R-R-X-R-R/S和H-R-R-R-R/S。4.2基因重组自然状态下发生的野毒株之间以及疫苗之间的基因重组,是引起IBV不断产生新的血清型的重要原因,这种遗传信息的改变可能是冠状病毒在自然界中生存的一个重要机制。Bochkov等用RT-PCR的方法扩增了10种IBV,并且对它们进行了测序。基于S1基因序列的进化分析显示有5株病毒属于793/B毒株,它们在组内拥有91.3%98.5%核苷酸相似性;有1株和624/I毒株有96.4%的同源性;另外2株以前在意大利已被检测出;其他3个变异株形成一个新的基因亚型。相反,基于更为保守

17、的N基因序列(包括1300个核苷酸的进化分析显示不同的分群。因此,彼此在S1基因序列有96.7%99.2%相似性的Italy-02亚型的3个变异株,在N基因序列上属于3个不同的亚型。他们的结果证明,基因重组和突变都是产生意大利分离株基因多样性的因素13。畜牧与饲料科学第32卷72DALTON K ,CASAIS R ,SHAW K ,et al .Cis-acting se -quences required for coronavirus infectious bronchitis virus defective -RNA replication and packaging J .J Vir

18、ol ,2001,75(1:125-133.邓小敏,叶柱德,王晶钰,等.鸡传染性支气管炎病毒N 蛋白研究进展J .动物医学进展,2007,9(28:78-82.LI F Q ,TAM J P ,LIU D X.Cell cycle arrest and apoptosis induced by the coronavirus infectious bronchitis virus in the absence of p53J .Virology ,2007,365(2:435-445.刘娟,吉文汇,闫芳.鸡传染性支气管炎研究进展J .畜禽业,2007(2:8-9.CALLISON S ,HIL

19、T D ,JACKWOOD M.Using DNA shuffling to create novel infectious bronchitis virus S 1genes:implica -tions for S 1gene recombination J .Virus Genes ,2005,31(1:5-11.FAN H ,OOI A ,TAN Y W ,et al.The nucleocapsid protein of coronavirus Infectious bronchitis virus:Crystal structure of its N -Terminal domai

20、n and multimerization properties J .Structure ,2005,13(12:1859-1868.IGNJATOVIC J ,SAPATS S.Identification of previously un -known antigenic epitopes on the S and N proteins of avian infectious bronchitis virus J .Arch Virol ,2005,150(9:1813-1831.CAVANAGH D ,CASAIS R ,ARMESTO M ,et al.Manipu -lation

21、of the infectious bronchitis coronavirus genome for vaccine development and analysis of the accessory proteinsJ .Vaccine ,2007,25(30:5558-5562.徐晓静,乌日罕,王立声,等.鸡传染性支气管炎分子生物学研究进展J .畜牧与饲料科学,2005,26(2:28-30.XU C ,ZHAO J ,HU X ,et al.Isolation and identification offour infectious bronchitis virus strains i

22、n China and analyses of their S 1glycoprotein gene J .Vet Microbiol ,2007,122(1/2:61-71.PARK J Y ,PAK S I ,SUNG H W ,et al.Variations in thenucleocapsid protein gene of infectious bronchitis viruses isolated in Korea J .Virus Genes ,2005,31(2:153-162.BING G X ,LIU X ,PU J ,et al.Different genotypes

23、ofnephropathogenic infectious bronchitis viruses co -circulat -ing in chicken population in China J .Virus Genes ,2007,35(2:333-337.BOCHKOV Y A ,TOSI G ,MASSI P ,et al.Phylogeneticanalysis of partial S 1and N gene sequences of infectious bronchitis virus isolates from Italy revealed genetic diversit

24、y and recombination J .Virus Genes ,2007,35(1:65-71.HUANG Y P ,WANG C H.Sequence changes of infectiousbronchitis virus isolates in the 37.3kb of the genome after attenuating passage in embryonated eggs J .Avian Pathol ,2007,36(1:59-67.Mondal S P ,LUCIO-MARTINEZ B ,NAQI S A ,et al.Isola -tion and cha

25、racterization of a novel antigenic subtype of in -fectious bronchitis virus serotype DE072J .Avian Dis ,2001,45(4:1054-1059.5IBV 的进化IBV 新毒株的出现主要是由IBV 基因组发生突变和重组引起,前面综述的病毒变异理论中的一种观点认为,IBV 基因组很容易出现突变、产生新毒株14。除此以外,如果从饲养环境、免疫压力及自然选择等方面来寻找IBV 变异株的来源,应该考虑以下两点15:适应性变化及免疫压力造就“新毒株”,在长期应用IB 疫苗的地区不断出现“新毒株”;引进“

26、新毒株”,这主要指新品种的带毒引入及国外疫苗毒株的引进产生非当地的新流行毒株。现在人们对IBV 的进化研究越来越多。Mondal 等对1999年发现的Cal199毒株进行了全基因组测序16。为了阐明基因材料的潜在资源,他们将这个毒株的结构蛋白和其他常用的疫苗毒株及世界其他地方的分离毒株的结构蛋白进行了比较。在基于序列比对上,除了S 1基因和S 2及M 蛋白基因分别和Conn 毒株及Mass 毒株更亲近外,Cal199毒株和ArkDPI 毒株毒株相似。他们推测S 1基因和S 2及M 蛋白基因分别来自Conn 毒株和Mass 毒株,并且和ArkDPI 的一个毒株发生了重组。因为ArkDPI 毒株、

27、Conn 毒株和Mass 毒株在加利福利同时被用作活疫苗,点突变和重组为新的Cal199毒株的出现做出了贡献。Liu17等得到了中国在19952004年暴发的26株IBV 分离毒株,他们将这26个分离毒株和其他5种分离毒株进行了比较。结果表明,运用疫苗以前的流行毒株和作为活疫苗引进的毒株,两者的基因改变产生了中国的IBV 。然而,Ignjatovic 18等人发现了一种新的IBV 病毒株,它不属于以往的亚群1和亚群2而应该属于新的一种亚群,即亚群3。他们人为由于澳大利亚的地理隔离,就像1988年出现的亚群2一样,亚群3的出现不能用现在人们普遍接受的IBV 的子代变异的机制来解释。6IBV 的鉴

28、定和检测目前,对IBV 进行检测和鉴定的方法很多,主要有血凝试验、血凝抑制试验、致病性试验、致鸡胚矮小化试验、电镜特征鉴定、RT-PCR 鉴定、核酸探针技术、单克隆抗体技术等。倪斌等用RT-PCR 方法对榆林分离得到的毒株进行鉴定取得良好效果19-21。Escutenaire 等用实时定量RT-PCR 对几种冠状病毒进行检测。结果表明,实时定量RT-PCR 的方法有很高的特异性,并且能区分不同动物的临床送检样品22。孟凡磊等制备出地高辛标记的IBV 核酸探针23,特异性检测结果表明,该探针能与不同毒株的IBV 核酸发生特异性杂交,而与对照的NDV 、鹅副黏病毒的核酸杂交反应为阴性;敏感性检测结

29、果表明,该探针对IBV 的最低检出量为10pg ,显示所制备的核酸探针用于IBV 的检测是可行的。单克隆抗体(McAb 具有针对单个抗原决定簇的高效特异性、敏感性。McAb 与基因定位、基因重组等技术结合,可将保护性抗原定位到基因水平。因此,近年来,这种新技术运用于IBV 研究取得了满意的成果9,24-26。随着养禽业的进一步发展,新的疾病或新的血清型的病原不断出现,IBV 作为危害鸡的重要疾病之一,必须建立快速、有效的诊断方法。随着对IBV 分子生物学技术的进一步完善和发展,对IBV 结构的研究会越来越深入,并能够建立更为快速、简便的分子生物学诊断方法,研制出有效而经济的疫苗,最终控制IB

30、的发生。参考文献:123456789101112131415宋显章等:鸡传染性支气管炎病毒分子生物学研究进展第1期73MONDAL S P ,CARDONA C J.Genotypic and phenotypiccharacterization of the California 99(Cal99variant of infec -tious bronchitis virus J .Virus Genes ,2007,34(3:327-341.LIU S W ,ZHANG Q X ,CHEN J D ,et al.Genetic diversity ofavian infectious br

31、onchitis coronavirus strains isolated in China between 1995and 2004J .Archives of Virology ,2006,151(6:1133-1148.IGNJATOVIC J ,GOULD G ,SAPATS S.Isolation of a vari -ant infectious bronchitis virus in Australia that further illus -trates diversity among emerging strains J .Archives of Vi -rology ,20

32、06,151(8:1567-1585.倪斌,张彦明,孙裴,等.鸡肾型传染性支气管炎病毒的分离鉴定J .中国兽医科技,2005,35(5:377-380.徐雪,孙彦婷,王宏魁,等.免疫鸡群肾型传染性支气管炎病毒的分离和鉴定J .安徽农业科学,2009,37(19:8881-8882,8887.杨帆,李淑梅,汤波,等.鸡传染性支气管炎病毒的分离鉴定J .安徽农业科学,2008,36(8:3226-3227,3249.1617181920212223242526ESCUTENAIRE S ,MOHAMED N ,ISAKSSON M ,et al.SYBR Green real -time reve

33、rse transcription -polymerase chain reaction assay for the generic detection of coronavirus -es J .Archives of Virology ,2007,152(1:41-58.孟凡磊,刁有祥,王辉,等.鸡传染性支气管炎病毒地高辛标记探针检测方法的建立和应用J .福建农业学报,2007,22(1:39-42.王春丽,王宏俊,赵权.鸡传染性支气管炎病毒S 1基因的原核表达及生物活性分析J .安徽农业科学,2010,38(20:10692-10694.景小冬,章振华,李林,等.SPF 产蛋鸡IB HI

34、 抗体滴度与攻毒保护的相关性试验J .安徽农业科学,2010,38(17:9008-9010,9076.YIN G Y ,SUN J ,SU J ,et al.Analysis on heredity and vari -ation of the ORF5gene of prevalence strains porcine repro -ductive and respiratory J .Agricultural Science &Technol -ogy -Hunan ,2009,10(5:88-91.(责任编辑:钱英红牛病毒性腹泻病实验室诊断方法的研究进展曹安民1,黄显明2,郭保国1(1.安徽省长丰县畜牧水产局,安徽长丰231100;2.南京天邦生物科技有限公司,江苏南京211102摘要:牛病毒性腹泻是由牛病毒性腹泻病毒引起的,以出现多症状、持续性感染和免疫抑制为主要特征,呈世界性广泛流行。主要对用于该病的病原学诊断、血清学诊断和分子生物学诊断等实验室诊断方法进行综述,以期为建立更加快速、有效的诊断方法提供参考。关键词:牛病毒性腹泻;牛病毒性腹泻病毒;分离鉴定;实验室诊断中图分类号:S854.43文献标识码:A文章顺序编号:1