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1、转基因植物口服疫苗的免疫机制研究进展李林习佳飞摘要植物作为新型的生物反应器正日益受到关注,转基因植物以其独有的可食(饲性成为疫苗研究的热点之一。目前转基因植物口服疫苗的可行性已逐步得到证实,但相关的免疫机制尚在进一步的探索之中。实验证实植物细胞壁类似天然的“生物胶囊”,可在一定程度上保护表达在植物细胞内的疫苗抗原蛋白抵御消化道酶的作用。使疫苗抗原特异地定位表达于植物细胞的内质网、叶绿体等细胞器中,以及将抗原蛋白组装成病毒样颗粒,也均可增强其抗消化能力。适当选用免疫佐剂等可增强转基因植物疫苗免疫保护反应,选择合适的启动子等可提高目的基因在转基因植株中的表达量,这些均是增强转基因植物口服疫苗免疫保

2、护反应、避免免疫耐受的可行策略。关键词转基因植物;口服疫苗;免疫机制;生物胶囊;免疫佐剂文章编号1001-103X (200406-0354-04中图分类号R392.13文献标识码:A基金项目:国家自然科学基金项目(39979924;广东省自然科学基金项目(001052作者单位:510515广州,南方医科大学临床医学本科审校者:南方医科大学病原生物学教研室周晓红陈晓光转基因植物疫苗是当今疫苗研制的热点之一。与常规的注射疫苗相比,其生物量大、靠光合作用方式生存、可在大范围内种植与栽培、成本低廉、运输与保存容易,而且用可直接食用的果蔬如番茄、香蕉等作为新型疫苗分子表达系统,可口服接种,免除了打针带

3、来的经济负担和疼痛,这些较其他生物有着不可比拟的优势。近年来,转基因植物通过口服途径诱导免疫应答的能力已经逐步得到证实,其不仅能表达外源疫苗蛋白,还可激发机体有效的粘膜免疫和系统免疫保护1,2。但转基因植物口服疫苗的研制目前尚处于起步阶段,口服后植物疫苗是否能抵御消化道酶的消化?产生粘膜免疫保护机制?当疫苗蛋白在转基因植物中表达量低,有可能产生口服免疫耐受时,采取何种策略能增强其免疫保护反应的产生而避免免疫耐受?这些问题的解决是转基因口服疫苗研究走向应用的前提,本文就近年来转基因植物口服疫苗相关免疫机制的研究进展综述如下。1转基因植物口服疫苗诱导粘膜免疫及其机制1.1转基因植物口服疫苗可行性的

4、实验依据1990年,Curtiss 2等证实了转基因植物所表达的抗原具有免疫活性。1992年,Arntzen 3等利用转基因烟草生产乙型肝炎疫苗的研究证明,在转基因植物中表达的蛋白不仅可保持蛋白的天然构像,还保留了激发B 细胞和T 细胞免疫反应的抗原决定簇。K apusta 4等利用表达rH BsAg 的转基因生菜对志愿者进行了口服疫苗的初步测试。5人为志愿者,3人为实验组,第一次给予转基因生菜(rH BsAg 0.10.5(g 100g 生菜200g ,在两个月内给予第二次免疫,给予生菜150g 。在给予第一次抗原后第2和4周,检查志愿者的血清,没有发现H BsAg 的特异性抗体。在给予第二

5、次抗原后两周,1人血清的特异性抗体水平为3I U L ,另两人血清的特异性抗体水平高于10I U L (目前规定肝炎疫苗的特异性保护抗体的水平须高于10mI U ml 。在给予第二次抗原4周后志愿者的抗体水平下降到了1.7I U L ,但到12周为止抗体水平没有继续下降。说明了转基因植物口服疫苗能有效地诱导人体免疫系统产生抗原特异性的免疫反应。1.2植物细胞壁的“生物胶囊”(bioencapsulation 作用K ing 5对服用纯化的rH BsAg (酵母中表达和未加工的H BsAg 转基因马铃薯所激发小鼠的免疫反应性进行了比较。用表达H BsAg 的马铃薯(含有8.35gH BsAg g

6、 马铃薯免疫小鼠,每只小鼠每次给予马铃薯5g +10g 霍乱毒素(Cholera T oxin ,CT ,每周1次,连续3周。对照组用明矾吸附的酵母表达的抗原免疫小鼠,每只小鼠每次给予150grH BsAg +10gCT ,每周给予1次,连续两周。在服用两次酵母表达的rH BsAg (总剂量为300g 后,直至第六周都未能检测到针对rH BsAg 的特异性抗体(即没有发现初始免疫反应。而在服用了两次表达H BsAg 的转基因马铃薯(总共含有rH BsAg 85g 后,就产生了初始免疫反应,在给予3次抗原之后,抗体水平达到了103mI Uml,并且到11周时,抗体的水平仍然高于10mI Uml。

7、当小鼠的初次免疫反应的抗体量降到了基线水平后,都经非肠道途径给予0.5g明矾吸附的酵母表达的抗原。经酵母表达的抗原+CT免疫的小鼠在第七周产生了175mI Uml水平的再次免疫应答抗体。经表达H BsAg的转基因植物+CT免疫的小鼠迅速产生了更强烈的再次免疫应答,特异性抗体水平高达3300mI Uml,并且到第五个月后抗体仍然保持较高的水平(700mI Uml。由此可见,口服转基因马铃薯可诱导产生特异性免疫反应,且口服转基因植物疫苗较纯化抗原具有更好的诱导特异性免疫反应的能力。原因可能是植物细胞壁具有类似天然的“生物胶囊”(bioencapsulation作用,即植物细胞的细胞壁在一定程度上可

8、有效地保护植物细胞内表达的rH BsAg,rH BsAg在未到达肠道的免疫反应激活位点(如Peyers淋巴结等之前被蛋白酶降解,从而相应地增加了肠道免疫系统摄取抗原的量和几率。另外,也可能是由于植物细胞在肠道内分解的次级代谢产物能减少H BsAg在肠道内的分解。2增强免疫保护、避免免疫耐受的策略分析2.1组装成类病毒颗粒可提高抗原抗消化作用可溶性抗原激发免疫反应的能力较弱,且易在胃肠道中被消化。病毒在通过消化道途径感染过程中,能抵抗胃酸和消化酶的消化作用,且病毒的颗粒性状具有很强的免疫原性。若将抗原组装成病毒样颗粒,既能增强抗原蛋白抵抗胃肠道消化作用的能力,提高粘膜免疫系统摄取抗原蛋白的量,又

9、能增强抗原的免疫原性,从而增强免疫反应。Mas on6等将诺瓦克病毒的衣壳蛋白(Norwalk virus capsid protein,NVCP基因转入烟草和马铃薯中,并用表达NVCP的烟草叶和马铃薯块茎喂饲小鼠产生了针对NVCP特异性抗体。T acket7用表达组装成病毒样颗粒的NVCP的转基因马铃薯对24名志愿者进行了口服免疫测试,在服用3次剂量(每次给予150g生的马铃薯,共含有2152751gNVCP的20名志愿者中,19人(95%产生了特异性IgA抗体分泌。其中4人(20%产生了特异性IgG抗体,6人(30%的粪便中发现特异性IgA抗体。由此可以看出将抗原组装成病毒样颗粒是转基因植

10、物口服疫苗抗原提高抗消化能力、增强免疫反应性的一种可行手段。2.2抗原在植物细胞器内的定位表达通过修饰外源基因,可以使蛋白特异性地表达于叶绿体、内质网等细胞器内,可以增强蛋白的表达,这些细胞器的质膜又可以保护所表达的抗原,从而增强转基因植物作为疫苗的效能。S ojikul8等模拟人体感染乙肝病毒后乙肝表面抗原在细胞内的合成过程,通过对外源基因(H BsAg基因进行修饰,在其氨基末端加上不能被剪切的大豆的信号蛋白vspA (s oybean vegetative storage protein vspA VSPS基因。经实验证明,此修饰能增强VSPS2H BsAg融合蛋白的表达。VSPS能增强分

11、子间二硫键的形成,从而增强H BsAg形成低聚体的能力,增强H BsAg的免疫原性。且VSPS2H BsAg融合蛋白更稳定,具有比未修饰的H BsAg更高的“a”抗原决定基(所有H BV共同的一种抗原决定基产生率。用植物表达的VSPS2H BsAg 融合蛋白免疫动物,能产生比植物表达的未修饰的H BsAg更高的抗体反应水平。Liz9等通过在H BsAg的N端加入可被剪切的植物信号肽,使H BsAg能更好地表达在植物细胞的内质网中,并增加H BsAg的表达量,促进H BsAg组装成病毒样颗粒形态。其中pH B106含有大豆VSP“S”信号肽(the s oybean VSP“S”signal p

12、eptide,pH B107含有VSP“L”信号肽(the VSP“L”signal peptide大豆VSP“S”信号肽再加上一段内质网靶向序列。在不同的植株中,H B107表达产生的H BsAg的抗原量最多,为2.4mg。给予小鼠连续3周每周1次每次5g生的表达H BsAg的马铃薯(含有H BsAg1.1gg,并加10gCT作为免疫佐剂。在最后1次免疫后3周小鼠血清中H BsAg特异性抗体水平达峰值,为73mI Um L。此后3周抗体水平逐渐下降。再次腹腔给予0.5gH BsAg抗原后,迅速产生了强烈的抗体免疫反应。由此可看出,将抗原特异性地表达于植物细胞的内质网等细胞器内,不仅能增加抗原

13、在植物中的表达量,还能增强转基因植物诱导出的免疫反应的强度。2.3免疫佐剂的适当应用添加免疫佐剂是提高免疫反应强度的有效方法,在非植物疫苗中已经被多次证实。对于植物疫苗,在抗原基因转入的同时加入免疫佐剂的基因,使转基因植物在表达抗原蛋白的同时也表达免疫佐剂,应是提高转基因植物口服疫苗免疫反应性的可行策略之一。目前常用的免疫佐剂有霍乱弧菌的霍乱毒素(Cholera T oxin,CT和埃希氏菌属大肠杆菌的不耐热肠毒素(Escherichia coli labile enterotoxin,LT。据报道10-12,CT的主要靶细胞是肠道的上皮细胞。CT在肠道被表皮细胞摄取之后,通过刺激相关的细胞分

14、泌细胞因子而增强免疫反应。CT能显著刺激Th2相关的细胞因子I L24、I L25、I L26、I L210(尤其是I L24的分泌。LT作为免疫佐剂的机制与CT相类似。据目前的研究1,LT主要通过增强抗原递呈细胞(如巨噬细胞、树枝状细胞表达B721(C D80、B722(C D86,从而增强协同刺激信号,增强机体的免疫反应。但是天然的CT(n2CT及天然的LT(n2LT都有很强的肠毒性,目前主要有两种方式可降低其毒性。一种方式是用这两种毒素的B亚基代替。n2CT和n2 LT都由两种亚基组成,分别为A亚基和B亚基。其中A亚基为毒性决定亚基,B亚基为无毒性决定亚基。有实验证明CT2B和LT2B都

15、可作为免疫佐剂13,14。但是也有一些实验结果显示,CT2B虽能刺激机体产生针对CT2B本身的抗体,但在促进机体产生针对旁观抗原的特异性抗体方面则作用较弱5,15。另一种方式是利用定点突变技术,置换CT2A或LT2A 肠毒性的决定基中的单个蛋白,使其产生无毒性或低毒性突变体,同时保留n2CT或n2LT的免疫佐剂活性。Douce16、Y amam oto15等在CT2A亚单位置换单个氨基酸,产生CT的低毒性或无毒性的突变体。他们成功地生产出的突变体有:CTS106,将CT2A的第106位点的脯氨酸突变为色氨酸(CT2A106PW,CTS106的肠毒性是n2CT的1104;CTK63(CT2 A6

16、3WK,CTK63完全无肠毒性;S61F(CT2A61S F;E112K(CT2A112EK。通过实验证明,这些突变体与n2CT相似,能有效地刺激粘膜免疫相关因子的表达,增强免疫反应。目前通过定点突变技术已经生产的LT的几种无毒的或低毒性的突变体有:LTK63(LT2A63SK,LTK63完全无肠毒性; LTR72(LT2A72AR,LTR72有n2LT0.6%的肠毒性;LTK7(LT2A7RK,LTK7无肠毒性等。在非植物疫苗添加免疫佐剂的研究中还发现,将n2CT或CT2B与抗原用化学方法偶联在一起免疫动物,可以较单纯地将n2CT或CT2B与抗原混合在一起免疫动物诱导出更强的免疫反应。这可能

17、与n2CT或CT2B 的靶向作用相关。即CT或CT2B将抗原与抗原递呈细胞(如肠系膜的M细胞,表皮细胞等相连在一起,使抗原递呈细胞能更好地摄取抗原并激活免疫系统17,18。提示,若能将抗原基因与佐剂基因连接后转入植物载体中,使植物表达抗原和佐剂的融合蛋白,则能大大地增强转基因植物所诱导出的免疫反应。在Y u19的实验中,在CT2B亚基C端,连接了轮状病毒肠毒素蛋白的免疫优势抗原决定基NSP4(轮状病毒的非结构糖蛋白,将融合蛋白的基因转入马铃薯中表达,得到了表达融合抗原的马铃薯免疫小鼠。用与免疫小鼠的转基因植物中含有相同抗原量的NSP4加入或不加CT2B(10m作为对照。抗体滴度测定显示,表达融

18、合蛋白的转基因植物所诱导的免疫反应最强。由此可知将免疫佐剂与抗原基因连接共同表达于植物中,能有效增强转基因植物疫苗所诱导出的免疫反应。在此次实验中还发现,用表达CT B2NSP4的马铃薯免疫小鼠能同时诱导小鼠产生针对CT2B和NSP47的抗体反应。可以推测,在保证各种抗原的表达量的前提下,可在一植株中同时转入几种不同的抗原基因,可在服用一种植物疫苗后同时产生针对几种病原体的免疫防御作用。2.4提高疫苗分子在转基因植株中的表达量口服抗原既有诱导免疫反应的能力,又能诱导口服耐受。口服耐受是指口服某种抗原后引起再次遇到相同的抗原时机体的无应答现象。这方面的机制还不清楚,主要与克隆清除、失能和主动性细

19、胞抑制相关。接种抗原的剂量是决定引起免疫反应或免疫耐受的主要原因。低剂量抗原易引起主动抑制;高剂量抗原易引起克隆清除和失能20。由于转基因植物中表达的抗原蛋白量通常较低,所以有可能引起低剂量耐受。度上提高外源基因在转基因植株中的表达量。综上所述,转基因植物口服疫苗能有效地诱导机体产生粘膜免疫和系统免疫反应,具有良好的可行性。全球每年约有二百万儿童死于因无法接种疫苗,在贫困落后地区更为严重。WH O相应提出研制价廉且可口服的疫苗新策略,转基因植物以其独具的可食性无疑最具开发潜能。随着转基因植物免疫保护机制的进一步阐明,转基因植物口服疫苗必将对许多疾病的防治尤其是在大范围、贫穷落后的国家和地区,起

20、到举足轻重的推动作用。参考文献1S treattield S J,H oward JA.Plant2based vaccinesJ.International Journal for Parasitology,2003,33:4792493.2W almsley AM,Alvarez M L,Jin Y,et al.Expression of the B subunit of Es2 cherichia coli heat2labile enterotoxin as a fusion protein in transgenic toma2 toJ.Plant Cell Reports.2003

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