酶解法对琉璃苣油脂的改良

1、酶解法对琉璃苣油脂的改良通过混合辛酸和二十碳五烯酸对油脂结构的酸化水解摘要：使用两种固定的酶，从球状菌提取的非特异性酶SP435和从米赫根毛霉中提取的sn-1,3特异性脂肪酶IM60作为生物催化剂对琉璃苣油脂结构进行重组。利用混合脂肪酸(中链脂肪酸10：0)和二十碳五烯酸(20：5n-3)作为游离脂肪酸的酰基供体.在己烷中完成的脂交换反应，用气液相色谱进行分析。改性琉璃苣油的脂肪酸组成和不改性琉璃苣油的脂肪酸组成是不同的。用IM60脂肪酶水解得到20:5n-3(10.2%)和10:0(26.3%)高度化合物,但用SP435脂肪酶水解，只有8.8的20:5n-3与15.5%10:0化合。尽管如此

2、，SP435脂肪酶能够在sn-2位置上10:0和20:5n-3化合，但IM60脂肪酶不能。在logP值进行酸解反应比在。关键词：琉璃苣油、念株菌属antarctica、脂肪酶、中碳链脂肪酸、n-3多不饱和脂肪酸、根毛酶属miehei、甘三酯。琉璃苣油脂是一种工业上制取必须脂肪酸-亚麻酸和谷氨酸的重要原料。近年来，通过研究发现所生产的谷氨酸可以用于皮肤病和其他一些疾病的治疗。对于人类和其他哺乳动物来说，谷氨酸是亚麻酸被-6去饱和酶酶解成前列腺素时的第一个代谢产物。过量的不饱和脂肪酸具有引导生物合成前列腺的机能.白细胞三烯类的2位和4位连在一起，在一定的环境下何以增强血管壁的收缩，血小板的凝聚力，

3、以及免疫力的提高和monokiness 降低。例如：20:5n-3不饱和脂肪酸对二位串联花生类脂肪酸的影响，通过对组织内花生四烯酸的代谢产物在去饱和酶及环氧化合酶合成脂肪酸组织过程中竞争来抑制脂肪酸的裂解。而三位的不饱和脂肪酸被考虑用于消炎，以往的研究证明。N3不饱和脂肪酸能降低心血管病的发病率三酰基甘油的类脂构造包括短链、中链、长链脂肪酸。在人们想得到的脂肪酸中，甘油分子被为是最有效释放胸腺嘧啶、腺嘌呤、鸟嘌呤的短链分子，从而得到营养品。因此作为功能性脂类，医学或医药用脂类，用于调理患的特非疾病病人的代谢状况，也可作为最好的营养品。但脂肪酸组织可能对免疫反应有影响，例如。综合花生四烯酸会导致

4、发炎。中链脂肪酸能更快的从血液中吸收，因为他的分子较小，且溶解性较大，在肠道内被快速的吸收氧化分解并转化为能量。对代谢紊乱的病人来说身体就能能获得高的能量。因为中链脂肪酸很少被转化为脂肪储藏在组织中，更多的则是被氧化成为能量。脂肪在酶解反应过程中，能够进行脂肪酸的重组。例如植物油的多不饱和脂肪酸酯基转移作用已经被成功的用于脂类的重组。在目前的研究当中，正试图用此方法来调整琉璃苣油脂当中的不饱和脂肪酸转化为18:3n-6,20:5n-3这两种固脂。我们在此将研究影响这以反应的因素，如摩尔比、反应时间、酶负荷、水及溶剂类型等。原料和方法：原料：琉璃苣油 ; 猪胰脂肪酶; 葵酸（10：0，纯度99）

5、从海绵中用化学方法提取（Co. ST .Louis. Mo）; 固脂 Sn-1；特异性酶IM60; 非特异性酶SP435。这个反应在北美洲，提供了新的生物条件。 包括：二十碳五烯酸 20:5n-3鱼油不饱和脂肪酸（纯度45%）苏格兰和英国览核王国的一些新兴公司提供。溶剂被分析后确定使用，完成。 除非特异性酶的存在，酶对琉璃苣油脂的重组反应是整体性的。酶解反应混合溶液包括：琉璃苣油（100mg）； 20：5n-3 (76mg)10:0(40mg) , 摩尔比分别1：2：2 和 10 的酶底物（w/w）和5的水。3ml的己烷 将该混合悬浮液放置在定轨振荡器上振荡。温度控制在55，每分钟200转，时

6、间为24个小时。然后放入4 分子筛。反应2个小时以后，所有成分达到平衡。用玄明粉把产物中的酶过滤除去后，分析产物。将改良后的琉璃苣油脂中的胸腺嘧啶，腺嘌呤，鸟嘌呤，通过薄层层析单独分离出来。再放入槽宽60的石英皿中，用石油醚/乙醚/乙酸(体积比为90：10：1)的混合溶剂作为显影溶剂。带状的中性粒分子在低于紫外线光谱辐射下被显影，再用含二氯荧光素0.2的甲醇喷雾，利用这种方法，将带状粒分子（胸腺嘧啶，腺嘌呤，鸟嘌呤）从薄层色谱板上擦除。放入3毫升含6的HCL的甲醇溶液进行甲基化，温度在7080摄氏度，反应时间为2个小时。反应生成的甲基脂肪酸酯通过二次萃取取出，并加入2ml己烷和过量的硫酸钠，通

7、入氮气进行浓缩。使用HP8590型气液相色谱议，其中毛细管柱为PB-255熔硅毛细管柱，长度30m，直径0.25mm（惠普公司提供）和FID检测器，对浓缩脂肪酸组分进行分析。两次采样温度分别为250和260摄氏度，操作时温度控制在190摄氏度，时间为5分钟，然后以每分钟20摄氏度的速度上升到215摄氏度，再通入氮气，气体流速为23ml/min。甲基脂肪酸的相对摩尔百分比被定量并通过联机的计算机将其与十七酸（17：0）的标准溶液曲线进行比较鉴定。 脂肪酸的特异性结构Sn-2对脂肪酸重组改良反应的影响。在琉璃苣油脂中的胸腺嘧啶，腺嘌呤，鸟嘌呤的脂肪酸特异性结构Sn-2的分布决定了重组改良反应的顺序

8、。琉璃苣油脂中的胸腺嘧啶，腺嘌呤，鸟嘌呤从薄层层析中被隔离开，再用猪胰脏脂肪酶催化合成2单酰基甘油。通过己烷/乙醚/乙酸（体积比为50/50/1）进行甲基化，最后用甘油从薄层层析皿中层析分离出来得到甲基脂肪酸酯。 结果讨论：对琉璃苣油脂的转酯基作用反应是通过Sn-1，3-特异性酶IM60和非特异性脂肪酶SP435对混合溶剂在己烷中进行催化，然后使混合液中的琉璃苣脂肪酸。混合溶剂为琉璃苣油，20：5n-3和10：0，摩尔比为1/2/2,反应时间为24小时。这个混合物中琉璃苣油的脂肪酸组成在不同摩尔比的反应底物条件下生成的产物不同，如表1所示结果显示混合物中 20：5n-3的分别在10的IM60和

9、8.8的SP435 含量大致相同，但是在 IM60含量为26.3的情况下10:0的含量要比SP435为15.5时要高。SP435在催化葵花籽油时产生较多的20：5n-3脂肪酸，因此被称为Sn-1，3特异性酯化酶，而IM60使部分纯度为45的不饱和游离脂肪酸成为20：5n-3的酰基供体。在IM60和SP435转酯基作用后琉璃苣油中总体的多不饱和脂肪酸含量分别减少了21.5和14.7，同时，饱和脂肪酸的含量增加。通过Foglia和Sonnet指示器，我们了解了这一催化反应的过程。例如，SP435在酰基转移的作用下使原来位置上的酰基分离，而将其余的基团保留下来。与此同时，n-6多不饱和脂肪酸被还原，

10、生成饱和脂肪酸，并进行重组得到20：5n-3和10:0的中链脂肪酸。控制酶促反应的时间必须是严格的，要求用尽量少的时间得到最多的产物并尽可能的降低生产成本。酯基转移作用的转化率如表2所示： 该图表展示出随着反应时间的增加，20：5n-3和10:0混合溶液中的胸腺嘧啶，腺嘌呤，鸟嘌呤的含量增加。大概在反应初期的1016个小时，生成的鱼油不饱和脂肪酸和癸酸的含量迅速提高。大约40小时左右以后混合物中的组分达到最佳。 随着酶促反应底物的摩尔比（胸腺嘧啶，腺嘌呤，鸟嘌呤：酰基供体、20：5n-3和10:0）的提高而使得酶的负荷反应能力有所增强。例如，酶IM60的最大负荷能力出现在10:0的含量为5.3

11、，而摩尔比在1：2：2和1：3：3之间的条件下，且20：5n-3的含量为5.5，摩尔比为1：1：1和1：2：2之间。我们曾尝试过在另外一些溶剂中进行反应实验，例如，异辛烷，戊烷，己烷，甲苯，丙酮和乙腈，最终确定了转化率较高的混合溶剂有20：5n-3和10:0以及己烷和异辛烷，如表2所示：这两种混合溶剂具有很高的P值，它的分配常数在水和辛醇之间。它们与P值相对较低的溶剂如戊烷和甲苯显示出更好的生物活性，而象丙酮和乙腈的P值则非常低。通过测定将20：5n-3和10:0这两种溶剂混合，会降低它们的P值，同时增强生物活性。经研究指出，一定量的水对于维持酶的三羧酸循环是必须的，不管怎样，通常过量的水会导

12、致酯化物水解。当SP435作为催化剂对植物油脂进行催化时，过量的水会减少其中20：5n-3的含量。如表3所示：通过表3可得出这样一个结论：20：5n-3和10:0在加入水以后SP435的活性降低，而在加入IM60时SP435的活性被加强。这说明IM60在酸性条件下进行脂肪酶解时比SP435具有更强的耐水性质。通常Sn-1，3-特异性脂肪酶按照其催化性质，对混合物中胸腺嘧啶，腺嘌呤，鸟嘌呤中的Sn-1和Sn-3位置单一进行催化后产生酰基，而不能象别的化学催化剂那样进行酯基转移作用，从而无法获得常规性产物。这种专门针对胸腺嘧啶，腺嘌呤，鸟嘌呤的Sn-1，3-特异性脂肪酶在大自然中非常少见，所以，我

13、们仅仅能够使用普通的脂肪分解酶来配制获得这种特性的脂肪酶。例如：利用IM60对胸腺嘧啶，腺嘌呤，鸟嘌呤的Sn-1和Sn-3位置和18:3n-6在Sn-2位上进行催化。而利用SP435对20：5n-3和10：0在Sn-2位置上进行催化。这时在自然界很难获得的特异性脂肪酸被轻易的得到。通过对中链脂肪酸和n-3多不饱和脂肪酸的催化 如表4所示：胸腺嘧啶，腺嘌呤，鸟嘌呤可以应用于饮食治疗疾病。因为，在大多数哺乳动物体内的脂肪酸，例如：通过胰脂肪酶的催化20：5n-3和10：0在Sn-1，3位置上被迅速分解释放能量，且 20：5n-3是除了18：2n-6最有可能获得必须脂肪酸的脂类。在通过IM60对琉璃苣油脂的改良时充当特异性脂肪酶对Sn-1,3，我们测定发现20:5n-3和10：0在Sn-2位置上被催化。而SP435则作为非特异性脂肪酶来使用。反应过程中，20：5n-3和10：0以及18:3n-6在Sn-2位置上不断缺失。10：0的Sn-2位置的存在可能是有用的。这种中链