海藻多糖对HL-60细胞体外增殖的影响

1、海藻多糖对 HL-60 细胞体外增殖的影响作者：林新梅 王国祥 陆羡 唐慎华【关键词】海藻【摘要】目的探讨海藻多糖对人 HL- 6 0细胞增殖的影响。方法采用集落培养、 MTT 、形态观察等方法，研究海藻 多糖对 (HL- 60)体外增殖的影响。结果海藻多糖对体外培养的 HL- 6 0细胞的抑制作用随时间和浓度的增加而增强，MTT结果示当浓度为 800 感/ml，作用 48 h时抑制率为(51.30 ± . 1 0)%。结论海藻多糖体外可抑制HL- 6 0细胞增殖，提示其在抗肿瘤方面有一定的开发应用前景。【关键词】海藻多糖； HL-60细胞；增殖【 Abstract】 Objecti

2、veTo explore the effect of seaweedpolyaccharide on the proliferation in the HL-60 cell line.MethodThe MTT,clone forming approaches and cell morphology were adopted.ResultsSeaweedpolyaccharide can inhibit the proliferation of HL-60 cells in a dose- and time-dependent manner in a certain range of dose

3、 (0 80 0g/ml) . After being treated with the polysaccharide (800 g/ijml) for 48 h,the in hibited rate is (51.30±3 . 10)%.C on slusi on The seaweed polysaccharide can in hibit the HL-60 cell proliferation,suggesting it can be used as an antileukemia drug. 【Key words】 seaweed polysaccharide,HL-60

4、 cell,proliferation 多糖在细胞的生命活动中起着重要作用，它参与了细胞的生长、分 化、衰老和死亡过程。我国传统中医常用马尾藻等治疗乳腺癌与子 宫癌,国外也开展了使用海藻多糖进行肿瘤防治的研究。本文采用由 湛江产马尾藻中提取的海藻多糖研究其对HL- 6 0细胞增殖的影响。 1 材料与方法 1.1试剂与仪器海藻多糖 (广东医学院刘秋 英硕士惠赠),RPMI- 1 6 4 0培养基(Gibco Co,USA )，四甲基偶 氮唑(MTT , Sigma 公司),Hoechst 33258(Sigma 公司)，碘化丙啶(PI, Sigma公司),4000 mPa.s甲基纤维素(Sigm

5、a公司)。仪 器：OLYMPUS IMT- I型倒置相差显微镜(Japan),丹尼 酶标仪 (Denmark), SW-CJ -IFD医用净化工作台(苏州安泰空气技术有 限公司),SHZ-LAB培养箱(U SA)。 1.2方法 细胞培养：HL- 6 0细胞株由广东医学院生化教研室提供。采用含 10%新生牛血清终浓度为100 U /ml青霉素、链霉素的 RPMI 1640 液体培养体系，置37C、5%CO2恒温培养箱中培养，隔天换液一 次。实验选用对数生长期细胞。 MTT 抑制实验：参照 文献1,2，将细胞以 2X105/ml密度接种于 96孔培养 板中，加入不同浓度的药物，置37 C、5% C

6、O2孵箱中分别培养24 h、48h、72h后，每孔加入 MTT(5 mg/ml)20卩1,继续培养 4 h,加入 MTT裂解液(20%SDS +5 0%DMF + 30 %H 2 0） 1 0 0 G,37C、5%CO2 孵箱中孵 育8 h,酶标仪检测各组细胞的 A630/A 5 7 0值，计算抑制率 （IR）。抑制率（IR） = （ 1用药组 A值/对照组 A值）X10 0 %。 半固体培养：培养体系为2X10 2/ml细胞，RPMI1640 培养基, 30%新生牛血清,不同浓度的药物,0.9%甲基纤维素，分别种入24孔板中，每孔1.5 ml,重复3孑L,置37C、 5%CO2孵箱中培养，于

7、第 7天计算细胞集落数，以每团大于 50 个细胞为一个集落。形态学观察：培养体系为2X10 5/ml细胞，RPMI 1640培养基，马尾藻多糖终浓度分别为0（对照）、300、5 0 0、800 ag/ml，加入 24 孔板中，每孔 2 m l,重复3孑L,分别在15 d,于倒置显微镜下观察细胞形态变 化，并拍照。统计处理：本实验数据资料用x 士s表示，使用SPSS10.0统计软件进行统计描述，采用SNK-q检验。 2结果2.1 MTT 结果以不同浓度（0、50、100、200、400、 8 0 0 ag/ml ）的海藻多糖作用于 HL- 6 0细胞24h>4 8h和72 h, MTT法检

8、测其对HL- 6 0细胞增殖的影响，见表1。 随着海藻多糖浓度的增加和作用时间的延长,抑制率逐渐增加。当 浓度为800 ag/ml，作用 48 h时抑制率为（51. 3 0 士3 . 1 0）%，与对照组相比差异有显著性（PV0 .01）。 表1海藻多 糖对HL- 6 0细胞增殖的抑制作用（略）2.2集落培养结果海藻多糖对HL- 6 0细胞集落形成有明显的抑制作用，在1008 00ag/ml浓度范围内，集落逐渐减少；浓度为 800 ag/ml时未见有细胞存活，仅见残余细胞碎片；与对照组相比，差异有 显著性（PV0 .0 1 ），结果见表2。表2海藻多糖对HL- 6 0细胞 集落形成的影响（x

9、士s,n = 3 ）浓度（ag/ml ）集落数 0219.67 士 6 .4 9 50 2 0 6 . 3 3 士3 .7 2 1 0 0 1 6 4 . 8 9 士7 .93 2001 0 6 . 8 9 士3 .9840026 .4 4 士1 . 58 8 0 0 0 . 0 0 士0 .0 0 与对照组相比 PV0 .05, PV0 .01;F=112 1.75。2. 3海藻多糖对 HL- 60细胞形态的影响处理后24h,各浓度组细胞形态与对照组未见明显差异，72 h各处理组可见部分细胞核变大，约为普通细胞的 12倍，以300 a /ml组 较多见。随着处理时间的增加,较大细胞逐渐增多,

10、少数体积达到 普通细胞的 34倍,相差显微境下可见部分较大细胞先是核膜边 缘出现多个突起后细胞核逐渐碎裂、分散,最终细胞破碎死亡。浓 度越高,出现破碎死亡的细胞越多。3讨论 白血病是人群发病率较高的恶性肿瘤之一,化疗是重要的治疗手段,但其副作用大是 其几乎不可克服的缺点。在祖国医学中,中草药在抗肿瘤中的应用 源远流长,如马尾藻等治疗乳腺癌和子宫癌。现代研究证明近 100 种中药多糖有不同程度的抗肿瘤作用。我们的研究结果表明，海藻 多糖对HL- 6 0细胞增殖呈明显抑制作用，且随药物浓度的提高和 作用时间的延长而增强。海藻多糖 100 临/ml作用24 h即可 见对HL- 6 0细胞增殖的抑制，

11、当浓度为 800 ig/ml、作用48 h时抑制率为(51.3 0 ±3 .10)%，与对照组相比差异有显著性 (P V0 . 0 1)。其作用机制尚不清楚，已有研究表明可通过以下机制 发挥抗白血病作用：抑制 DNA合成，干扰细胞代谢。刘力生等3报道螺旋藻多糖 (PSP)对癌细胞的抑制作用主要是通过对 DNA合成的抑制而起作用的。并认为 PSP的抑癌机制属于代谢性抑 制。影响细胞酶的活性。Sogawa等4研究发现海藻多糖可完 全抑制白血病K562细胞DNA拓扑异构酶活性，使白血病细胞不能 无限增殖。改变细胞膜的流动性。海藻多糖可提高S180荷瘤小鼠肿瘤细胞的膜流动性，降低 H22荷瘤小鼠肿瘤细胞