Rh血型系统研究进展

1、程变化等方面,脂联素测定也有一定意义。最近多项研究表明,脂联素的高分子量异构体(HMW与冠心病的相关性更强1-3。故今后通过大规模临床试验阐明HMW 在冠心病发生、发展中的意义,将是研究的热点。6.2 治疗 高血浆脂联素水平能在体内抑制动脉粥样硬化的发展。将表达人脂联素的腺病毒转染载脂蛋白E 缺乏的小鼠,第14d 后动脉窦处的动脉粥样斑块形成被抑制了30%,免疫组化分析显示腺病毒携带的脂联素转移入粥样硬化动脉处脂纹的泡沫细胞内19。脂联素具有抑制机械损伤后血管内膜反应性增生的作用。Matsuda 等发现,机械性动脉损伤可使脂联素基因缺失的小鼠出现明显的新生内膜增厚和平滑肌细胞增殖。而外源性补充

2、脂联素后,可减弱其新生内膜的增殖。这为冠心病血管介入治疗后,预防血管再狭窄提供了新的办法20。参考文献:1 Pajvani UB,Du X,Combs TP,et al .Structure -func tion s tudies of theadipocyte -secreted hormone Acrp30P adiponecti n:i mplications for meta -bolic regulation and bi oactivityJ.J Bi ol Chem,2003,278(11:9073-9085.2 Pajvani UB,Hawki ns M ,Combs TP,e

3、t al .Complex di stribution,not ab -s ol ute amount of adi ponectin,correlates with thiazolidinedione -mediatedimprove ment in insulin sensitivi ty J .J Biol Chem,2004,279(13:12152-12162.3 Kobayashi H,Ouchi N,Ki hara S,et al .Selective s uppres sion of endo -theli al cell apoptos is by the high mole

4、cular weight form of adi ponectinJ.Circ Res,2004,94(4:e27-31.4 Ohas hi K,O uchi N,Kihara S,et al .Adiponecti n I164T mutation i s as -s ociated with the metabolic s yndrome and coronary artery diseaseJ.JA m Coll Cardiol,2004,43(7:1195-1200.5 Stenvi nkel P,Marchlewska A,Pecoits -Fil ho R,et al .Adi p

5、onectin in re -nal disease:relations hip to phenotype and genetic variati on in the geneencoding adiponectinJ.Kidney Int,2004,65(1:274-281.6 Fruebis J,Tsao TS,Javorschi S,et al .Proteol ytic cleavage product of30-kDa adipocyte complemen-t related protei n i ncreases fatty aci d ox-i dati on in muscl

6、e and causes weight loss in miceJ.Proc Natl Acad Sci USA,2001,98(4:2005-2010.7 Lin LY,Lin CY,Su TC,e t al .Angiotensin II -induced apoptos is in hu -man endothelial cells is inhibi ted by adiponectin through restoration ofthe as soci ation bet ween endothelial ni tric oxide synthas e and heat shock

7、protein 90J.FEBS Lett,2004,574(1-3:106-110.8 Ouchi N,Ki hara S,Arita Y,e t al .Novel modulator for endotheli al ad -hesion molecules:adipocyte -derived plasma protein adiponectin J .Circulati on,1999,100(25:2473-2476.9Ouchi N,Ki hara S,Arita Y,e t al .Adipocyte -derived plas ma protein,adi ponectin,

8、suppresses li pid accumulati on and class A scavenger re -ceptor expression in human monocyte -deri ved macrophagesJ.Circula -ti on,2001,103(8:1057-1063.10 刘岩,邹大进,李慧,等.低脂联素血症是冠状动脉粥样硬化严重程度的重要标志J.中华内分泌代谢杂志,2005,21(1:5-8.11 Nakamura Y,Shi mada K,Fukuda D,et al .Implications of plasma con -centrations o

9、f adiponectin i n patients with coronary artery diseaseJ.Heart (Briti sh Cardiac Socie ty,2004,90(5:528-533.12Pischon T,Gi rman CJ,Hotamisligil G S,et al .Plas ma adiponectin levels and risk of myocardial infarction i n menJ.J AMA,2004,291(14:1730-1737.13Zoccali C,M allamaci F,Tripepi G,et al .Adipo

10、nectin,metabolic risk factors ,and cardi ovascular events among patients with end -stage renal diseaseJ.J A m Soc Nephrol,2002,13(1:134-141.14 Schulze MB,Shai I,Ri mm EB,et al .Adi ponectin and future coronary heart disease events a mong men with type 2di abetes J .Diabetes,2005,54(2:534-539.15Kumad

11、a M,Kihara S,Ouchi N,e t al .Adiponec ti n s pecifically i ncreased tis sue inhibi tor of metalloproteinase -1through interleukin -10expression in human macrophagesJ.Circulation,2004,109(17:2046-2049.16Kojima S,Funahashi T,Saka moto T,et al .The variation of plas ma con -centrations of a novel,adipo

12、cyte deri ved protein,adiponecti n,in pa -ti ents w i th acute myocardial infarc tionJ.Heart (British Cardiac Soc-i ety,2003,89(6:667.17Is hika wa Y,Akasaka Y,Ishii T,et al .Changes in the di stribution pat -tern of gelatin -bindi ng protein of 28kDa (adiponectini n myocardial remodelli ng after isc

13、hae mic inj ury J .His topathology,2003,42(1:43-52.18 洪洁,顾卫琼,张翼飞,等.胰岛素抵抗综合征患者血清脂连素和胰岛素敏感性的相关性研究J.中华内分泌代谢杂志,2003,19(3:173-176.19Yoshi hisa O,Shinji K,Noriyuki O,et al .Adiponecti n reduces athero -sclerosisi n apolipoprotein E -deficient miceJ.Circ ulati on,2002,106(22:2767-2770.20Matsuda M ,Shimomur

14、a I,Sata M.Role of adi ponectin in preventing vascular s tenosis.The mis sing link of adipo -vasc ular axis J.J Biol Che m,2002,277(40:37487-37491.收稿日期:2005-10-22 修回日期:2006-03-16Rh 血型系统研究进展卓传尚1(综述,卓孝福2,郭永建2(审校(1.福建医科大学,福州350004;2.福建省血液中心,福州350004中图分类号:R457.11 文献标识码:A 文章编号:1006-2084(200611-0684-03摘要:

15、Rh 血型系统是最具多态性的红细胞血型系统,在临床输血、新生儿溶血病和自身免疫性溶血性贫血中具有重要意义。本文就R H 基因结构、R H 等位基因、Rh 蛋白功能及Rh 血型基因分型等近年来的研究进展简要综述。关键词:R h 血型;R H 基因;等位基因;基因分型 The Research Progress of Rh B lood G roup System Z HUO Chuan -shang 1,ZHUO Xiao -fu 2,GUO Yong -j ian 2.(1.Fuj ian Medic al Unive rsit y ,Fuzhou 350004,China ; 2.Blood

16、 Ce nter o f Fujian ,Fuzhou 350004Abstract :Rh blood group s ys tem is the mos t polymorphic s ys te m of the human red cell blood groups havi ng great si gni ficance in clinical trans fusion,he molytic di seas e of the ne wborn (HDNand autoi mmune hemol ytic anemia (AIHA.This review summariz es the

17、 developing kno wledge of Rh blood group i n recent years,including Rh gene s tructure,and i ts allele,the function of Rh protei n and genotyping in Rh blood group.Key words :Rh blood group;RH gene;Allele;Geotypi ngRh 血型系统是最具多态性的红细胞血型系统,至少由46种不同抗原组成,其中与临床相关的主要为D 、C 、c 、E 和e 等5种抗原。Rh 血型不符可引起新生儿溶血病(HD

18、N、溶血性输血反应和自身免疫性溶血性贫血(AIHA。20世纪90年代初,Rh 血型系统cDNA 被克隆出来。此后,Rh 血型系统的研究取得了巨大进展,Rh 血型基因结构和多数变异体的分子基础已经阐明,Rh 血型基因分型的研究方兴未艾,Rh 血型蛋白功能研究也初现端倪。1 Rh 血型基因结构Rh血型基因(RH位于人类染色体1p34.336.1,由紧密连锁的RhD蛋白基因(RHD基因和RhCE蛋白基因(RHCE 基因串联排列组成。RHD基因和RHCE基因高度同源(93.8%,都有10个外显子和9个内含子,长分别为57932bp 和58575bp,都编码417个氨基酸1。二者的第8个外显子完全相同,

19、差异较大是外显子3、4、5、7、9和内含子4;与RHCE 基因相比,RHD基因的内含子4缺失651bp。R HD基因和RHCE基因的开放阅读框架(ORF在RH基因座位上方向相反,3c末端相对,相距约30000bp,包括下游Rh盒(Rhesus box和约20000bp的小膜蛋白1(SMP1基因。下游Rh盒起于RHD基因终止密码子3c端104bp处,长9145bp;此外,在距RHD基因起始密码子5c端约4900bp处还存在1个9142bp的上游Rh盒。上、下游Rh盒的方向与RHD基因相同,前二者同源性高达98.6%。在上、下游Rh盒的57017163之间有一段1463bp的相同区域,在该区域除下

20、游Rh盒有1个4bp的多聚体插入外,其他序列完全相同。Wagner等2认为R HD阴性单倍体是由上下游Rh盒触发的不等交换引起,并且确定RHD基因缺失的903bp断裂点区就位于该区域。2Rh蛋白及其功能RhD蛋白由RHD基因编码,携带D抗原,RhCE蛋白由RHCE基因编码,携带C P c和E P e抗原。RhD和RhCE蛋白结构相似,都是由416个氨基酸残基组成的疏水性非糖基化蛋白,分子质量分别为30103和32103;二者都有12个疏水跨膜结构域和6个细胞外环,其C端和N端都位于胞浆内。通常,2条RhD蛋白或2条RhCE蛋白与2条RhAG形成四聚体,再与CD47、Landsteiner-Wi

21、ener糖蛋白(简称LW糖蛋白和血型糖蛋白B(GPB等附属蛋白组成蛋白复合体插入红细胞膜,参与构成红细胞膜骨架,维持红细胞膜结构完整性3。Rh 蛋白还可影响红细胞膜上的其他骨架蛋白的表达,例如RhCE 蛋白表达明显减少或缺失(如D-表型都将使CD47表达下降3。此外,Rh蛋白可能还参与氨(NH3或铵离子(NH+4跨膜转运,维持红细胞内外电荷平衡。氨基酸序列分析发现Rh 蛋白家族(RhD、RhCE、Rh AG、RhBG和RhCG与原核生物铵转运体(Amt P MEP有共同的保守性区域。深入研究显示,表达RhAG的酿酒酵母氨转运体缺陷突变株能够利用氨为惟一氮源4,表达RhAG的非洲蟾卵对14C-甲

22、基-NH3Cl的摄取率比对照组高810倍5。此外,研究表明非红系Rh蛋白同源物RhBG和RhCG也能促进铵离子转运6。最近,Hemker等7研究显示,在NH4Cl类似物14C-甲基-NH3Cl溶液孵育后,调节型RHnull 红细胞(不表达Rh蛋白内积聚的14C-甲基-NH3Cl明显高于正常红细胞,而无效基因型RH null红细胞(表达少量Rh蛋白内积聚中等量的14C-甲基-NH3Cl。虽然上述研究表明,Rh 蛋白家族成员RhCE P RhD蛋白、RhAG、RhB G和RhCG以及Rh复合体具有参与NH3跨膜转运功能,仍需进一步的研究证实。3RH等位基因人类正常RH基因编码区序列一致,但在漫长的

23、进化途中,不同人种间发生各种不同的分子事件,包括基因缺失、基因重组和碱基变异等,形成了众多的RH等位基因。3.1R HD等位基因目前已经发现的RHD等位基因有80多种,其中单核苷酸多态性(SNPs引起的RHD等位基因达40多种,RHCE和RHD基因交换引起的RHD等位基因也有30多种。这些RHD等位基因可分为以下四大类:¹RhD阴性等位基因:大部分D阴性的高加索人和中国人完全缺失RHD基因,约有15.8%真实D阴性中国人携带RhD阴性等位基因8,而D阴性非洲黑人则普遍携带RhD阴性等位基因(82%,其中66%为RHD伪基因(RHD W9。目前已经发现22种不同的RhD阴性等位基因,其

24、分子基础包括基因重组(如各种RHD-CE-D杂交基因、碱基突变(如RHD48A、RHD 121T和RHD270A等、碱基缺失(如RHD488del4和RHD 710delC或插入(如RHD IVS8+1G>A和RHD IVS6+1-4de-l GTAA,904-905insGGC TT。碱基突变为错义突变或无义突变,碱基插入和缺失引起框移突变,导致终止密码子提前产生,最终的结果是红细胞表面Rh蛋白表达缺失;º部分D等位基因:该型的分子基础是碱基突变和基因交换,但是RHD基因的ORF未发生改变,导致RhD蛋白缺失一个或多个D抗原表位;例如,DÖ是高加索人最常见的部分D,

25、就是由于RHD基因的2、3或4个外显子被相应的RHCE基因的外显子所置换,分别为DÖa、DÖb和DÖc;»弱D等位基因:目前已经发现近30种弱D等位基因,其分子基础都是点突变,这些突变位点编码的氨基酸残基通常集中在RhD蛋白的213、149、179225和269397位氨基酸残基等4个区域,都位于RhD蛋白的胞质区或跨膜区,因此可影响该蛋白有效插入红细胞膜,导致红细胞膜上RhD蛋白表达量的下降10;¼D el等位基因:主要存在亚洲人群中,大约25.5%相对RhD阴性中国人实际为D el 表型8。目前已经报道的D el等位基因有6种11-14:

26、RHD1227A、RHD885T、RHDIVS3+1G>A、RHDdel1013bp、RHD (X418L和RHDIVS5-38del4,其中RHD1227A引起错义突变, RHDIVS3+1G>A和RHD885T引起mRNA剪接点改变,RHD (X418L则是由于RHD基因外显子10的1252和1253位核苷酸插入1个T核苷酸,引起框移突变,造成原先RHD基因翻译终止密码子TAA(X变成TTA(L,导致编码的RhD蛋白从417个氨基酸变为488个氨基酸。但是仍不清楚这些突变是如何造成RhD蛋白表达异常减少。3.2RHCE等位基因人类最为古老的RHCE等位基因为RHce等位基因,R

27、Hce等位基因经过突变或与RHD基因交换形成RHcE、RHCe和RHCE等位基因15。RHce、RHcE、RHCe 和RHCE等位基因进一步发生基因缺失(如D-、碱基变异(如ceMO、cE MI、ceEK、ceBI和ceAR等、或与RHD基因发生基因交换(如E变异体Ò和Ó型、ceNR和RHEKK等,产生众多的RHCE等位基因。目前至少已经发现22种RHCE等位基因1,而且随着研究的不断深入,还将不断发现新的R HCE等位基因。多数RHCE等位基因引起e抗原表达改变,少数引起E抗原表达异常,而影响c抗原表达改变的则较为少见。4Rh血型基因分型目前临床Rh血型鉴定仍采用传统的血

28、清学方法,该方法检测的结果较为准确,而且与临床输血和疾病相关性密切。但该方法的结果判定具有主观性,在弱的或混合视野型凝集反应时尤其突出,从而影响结果的可靠性;对于存在同种抗体或自身抗体的个体,其Rh血型的鉴定常需用酶或其他技术处理红细胞,这些处理往往会破坏红细胞表面抗原,从而可能影响鉴定结果,而且实验步骤较为繁琐;对多次输血或大量输血的患者,由于这些个体的外周血中存在大量的供者红细胞,因此用该方法通常难以准确定型;此外,Rh血型变异体众多,尤其是某些罕见变异体,不仅制备这些变异体的抗体的费用昂贵,也难以获得满意的谱细胞。随着Rh血型基因结构和多数变异体的分子基础的阐明,许多学者开始致力于Rh血

29、型基因分型的研究。第一个Rh血型基因分型方法建立于1991年,该方法应用Southern Blotting检测RhD基因型,但是该方法繁琐且需要特殊仪器,不适用于临床实验室。1993年,Bennett等16首次建立RHD 基因的聚合酶链反应(PCR分型方法,该方法通过检测RHD 基因3c端非编码区来预测RhD表型,但随后的研究发现该方法存在较大的假阳性和假阴性问题。近年来,出现了多种以PCR为基础的Rh血型基因分型方法,而以下列4种方法运用较多:¹PCR-序列特异性引物(PCR-SSP:根据RH基因特异性位点设计序列特异性引物,特异性扩增RH基因某个外显子或内含子,是最常用的Rh血型

30、基因分型技术之一。目前倾向于应用多重PCR-SSPs进行Rh血型基因分型,同时分析多个RH基因特异性位点,该策略因简便和准确而备受关注;ºPCR-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP:限制性酶切PCR 扩增产物进行长度多态性分析,可以检测限制性位点的单核苷酸替换,但是与PCR-SSP相比,PCR-RFLP比较繁琐费时,且不适用于多重PCR。PCR-RFLP在Rh血型基因分型上的两个重要应用是RHD合子型鉴定和D P c P C分型;»实时定量PCR:常用于检测孕妇外周血中微量的胎儿DNA,是胎儿Rh血型鉴定的首选方法,也适用于直接检测RHD合子型。最近研究显示,由于Rh盒

31、的DNA序列(尤其是非高加索人群存在较多变异,该技术在鉴定非高加索人个体的RHD合子型时优于PCR-RFLP和PC R-SSP法17,18。实时定量PCR的不足之处在于需要特殊的仪器,且费用昂贵;¼DNA测序:对PCR产物进行直接测序可以检测RH基因多态性,确定各种碱基变异位点,但费用较高,难以广泛用于临床。虽然Rh血型基因的分型技术有多种,但是单独运用这些技术检测RH基因的某个外显子或内含子,可能产生假阳性或假阴性结果。假阳性通常由无效等位基因引起,假阴性则由其他R H等位基因引起。目前,Rh血型基因分型策略通常是,根据不同民族或人群中RHD和RHCE等位基因分布频率和特点,设计特

32、异性引物,扩增RH基因的多个特异性位点及多种等位基因,从而即简化操作又准确分型,将假阳性率和假阴性率降到较低水平。目前Rh血型基因分型已逐渐进入临床应用,在2004年的国际输血联合会第28届年会上Danials等19提出以下5种情况可以应用血型基因分型:¹产前胎儿血型鉴定,预测胎儿和新生儿溶血病(HDFN的危险性;º多次输血患者或大量输血患者的Rh血型鉴定;»当血清学试剂质量较差或试剂短缺时,亦可用血型基因分型筛选供者;¼血型基因分型还适用于直接抗球蛋白试验(DAT阳性,但间接抗球蛋白试验(IAT又无法分型血液标本的鉴定;½作为血清学参比实验室

33、的辅助技术,用于试剂红细胞的筛选和质量控制20,也可以用于检测Rh血型变异体。5结束语Rh血型系统是最具多态性的红细胞血型系统,不同种族间的RH基因结构特点可能存在较大差异。目前,多数Rh血型的PCR分型方法是根据欧美人的RH基因结构特点建立的,不完全适用于中国人。要想建立针对中国人的Rh血型基因分型方法,首先必需深入研究各民族、各地区中国人R H基因结构特点,充分了解中国人各等位基因的分子基础与基因频率。值得注意的是,由于D el表型在相对D阴性中国人群中比率较高13,而真实D阴性个体可产生针对D el表型的同种抗D抗体17,因此,深入研究中国人D el表型及其分子生物学基础具有重要意义。参

34、考文献:1Westhoff C M.The Rh blood group s ys te m in review:a ne w face for thenext decadeJ.Trans fusion,2004,44(11:1663-1673.2Wagner FF,Flegel WA.R HD gene deletion occurred in the Rhesus boxJ.Blood,2000,95(12:3662-3668.3Dahl KS,Westhoff CM,Discher DE.Fractional attachment of CD47(IAPto the erythrocyt

35、e cytoskeleton and vis ual colocalization with Rhprotein co mplexesJ.Bl ood,2003,101(3:1194-1199.4Marini A M,Matassi G,Raynal V,et al.The human Rhes us-as soci atedRhAG protein and a kidne y homologue pro mote ammoni um transport inyeastJ.Nat Genet,2000,26(3:258-259.5Westhoff C M,Ferrer-i Jacobia M,

36、Mak D OD,et al.Identificati on of theErythrocyte Rh Blood G roup Glycoprotei n as a Mammalian A mmoniumTrans porterJ.J Bi ol Che m,2002,277(15:12499-12502.6Li u Z,Peng J,Mo R,et al.Rh Type B gl ycoprotein is a new member ofthe Rh superfamily and a putative ammonia trans porter in mammalsJ.J Bi ol Ch

37、e m,2001,276(2:1424-1433.7Hemker MB,Cheroutre G,van Zwieten R,et al.The R h c omple x ex-ports ammoni um from human red blood cellsJ.Br J Haematol,2003,122(3:333-340.8Shao CP,Maas J H,Su YQ,e t al.Molecular background of Rh D-pos-iti ve,D-negative,D el and weak D phenotypes in ChineseJ.Vox Sang,2002

38、,83(3:156-161.9Singleton BK,G reen CA,Avent ND,e t al.The presence of an R HDpseudogene containi ng a37base pair duplication and a nons ense muta-ti on in Africans with the Rh D-negative blood group phenotypeJ.Blood,2000,95(1:12-18.10Wagner FF,Gass ner C,M ller TH,e t al.Molecular Basis of Weak DPhenotypesJ.Blood,1999,93(1:385-393.11Wagner FF,Frohmajer A,Flegel WA.R HD positive hapl otypes in Dnegative EuropeansJ.BMC Genet,2001,2:10.12Chang TH,Wang JC,Yang TY,et al.Human R hDel Is Caused