高频电火花水针疗法对实验性骨关节炎软骨细胞凋亡的影响

1、    【摘要】  目的研究高频电火花水针疗法对骨关节炎家兔NO及软骨细胞凋亡的影响。方法应用关节制动的方法复制骨关节炎模型，18只造模成功的中国家兔，随机分为高频电火花水针组（简称A组）、水针刀组（简称B组）和对照组（简称C组），A组用高频电火花水针加手法治疗，B组水针刀加手法治疗，C组仅予以手法治疗。1次/d，疗程为1个月，用硝酸还原法检测关节滑液中NO含量；用流式细胞仪检测软骨细胞的凋亡率。结果A、B、C组关节滑液中NO的含量分别为（33.67±17.72）mol/L、（58.90±22.07）mol/L，（

2、83.30±16.20）mol/L，软骨细胞的凋亡率分别为（25.27±10.82）%、（51.71±12.42）%和（74.80±9.37）%。3组间差异有统计学意义。结论与水针刀相比较，高频电火花水针疗法能更显著减少关节液NO的含量，抑制软骨细胞的凋亡，治疗膝骨性关节炎疗效好。 【关键词】  膝骨性关节炎 细胞凋亡 一氧化氮 高频电火花水针疗法Abstract：ObjectiveTo study the effects of drug-electric acupotomy (DEA) therapy on nitric oxide

3、 (NO) content and articular chondrocyte apoptosis in rabbits with Osteoarthis(OA).MethodsThe OA rabbit model was established by immobilized in full extension for up to six weeks. Eighteen rabbits were randomly divided into the DEA group (treated with DEA), the acupotomy  group (treated wit

4、h acupotomy and manipulation) and the control group (treated with manipulation alone). The treatment was applied once every three days for 1 month as a course. NO in articular synovia was measured by nitrate reduction method, and the apoptosis rate of  chondrocyte was determined by flow cy

5、tometry. ResultsNO content in the A, B, and C groups  was（33.67±17.72）mol/L,（58.90±22.07）mol/L and（83.30±16.20）mol/L respectively, and the apoptosis rate in the three groups was（25.27±10.82）%,（51.71±12.42）% and（74.8±9.37）% respectively. There was significant d

6、ifference among the three groups. ConclusionCompared with the acupotomy plus drug manipulation, DEA plus manipulation could reduce the NO content in synovia fluid and inhibit the apoptosis rate of chondrocytes in treating osteoarthritis of knee joint.Key words：Osteoarthritis of knee joint; 

7、0;Cell apoptosis;  Nitric oxide;  Drug electric acupotomy      骨关节炎(osteoarthritis, OA)是一种以关节软骨退行性变和继发性骨质增生为主要病理特征的慢性关节疾病。临床上以膝骨关节炎最为常见，尤其在老年人群中发病率高，由于对OA的发病机制缺乏足够的了解，目前尚未找到治疗OA的理想而有效的方法，但延缓关节软骨退变是从本质上防治OA的关键。本实验建立兔OA模型，观察高频电火花水针疗法对OA软骨细胞凋亡的影响。为该疗法在临床上的应用提供一定的

8、科学依据。1  器材与方法1.1  动物与分组 实验选用8月龄左右，体重2.02.5 kg的中国家兔30只，雌雄不限，由武汉大学实验动物中心提供。造模前随机抽取3只为正常对照，27只行石膏固定。6周后因死亡等原因排除6只，剩下动物随机抽3只做病理分析，确定模型成功后随机分成3组，分别为高频电火花水针治疗组（A组）、水针刀组（B组）、和对照组（C组）每组6只。同等条件下分笼饲养。1.2  仪器和试剂 EPICS XL型流式细胞仪，美国BECKMAN COULTER 公司；754分光光度计，上海分析仪器总厂；DCH-2000X骨伤疼痛治疗

9、仪（鄂食药监械（准）字（2005）第2260812号），三峡大学康复医学研究中心研制生产。Annexin -FITC 凋亡试剂盒，IMMUNOTECH 公司；胶原酶型，GIBCO 公司；NO试剂盒，南京建成生物工程研究所。1.3  方法1.3.1  造模方法先剪去所有动物右后肢踝关节以上的兔毛，用管型石膏将其右后肢伸直位固定，石膏外以透明胶纸封好，以防兔撕咬，如石膏松动或脱落及时重新固定。制动满6周时随机处死3只，取关节软骨作病理检查以观察造模情况，确定模型成功后解除石膏外固定。1.3.2  针刀制作将医用12号注射针头的针尖去掉，使

10、之成斜坡形平直状刃口，保留针孔，磨光滑锋利，高压消毒备用。1.3.3  药物维生素B1注射液50 mg，维生素B2注射液5 mg，维生素B6100 mg，当归注射液2 ml，2%利多卡因注射液2 ml配制成混合液。以上注射液均为普通市售药品。1.3.4  治疗方法 造模成功1周后，将动物固定在兔台上，对患膝行经络诊察，于关节周围主要是髌骨周围、内外关节间隙等处找到条索状物并用龙胆紫定点，局部常规备皮、消毒。术者按术前常规双手消毒，左手固定进刀点，右手持针刀，刀口线与肌纤维或韧带走向平行，将刀锋压在皮肤上，使皮肤形成一长方形凹陷，使神经血管分离在刀的两旁，

11、然后突然用力，针刀刺入皮肤，缓慢深入直达骨面，先作纵形疏通，然后再作横形剥离，如有结节务必切开，直至刀下有松动感时，停止上述操作，将套在针刀上的药液，缓慢注射，广泛浸润，同时在针柄处用DCH-2000X骨伤疼痛治疗仪施加高频电火花12 min。酒精棉球压迫针孔片刻，以不出血为度，然后用创可贴包扎针孔。每次选点24个，每点注射药液24 ml。手术完毕手法放松患膝周围的软组织，并对患肢行牵引拔伸和被动屈曲手法，此时多可闻及软组织松解的“喀嚓”声。以上治疗均1次/3d，10次为1个疗程。    水针刀组：除不施放高频电火花外，其他治疗同高频电火花水针组。对照组：仅给予手法治疗。1

12、.3.5  观察项目及检测方法1.3.5.1  关节液的抽取 施行膝关节穿刺，证实刺入关节腔后，注入0.9%的生理盐水1 ml，反复回抽、注入3次后，再尽量抽出腔内液体，1 000 r/min离心5 min，取上清液保存于-20冰箱中待测。1.3.5.2  软骨标本采集将兔敲击头部致死后，立即切开右膝关节腔，先大体观察关节软骨、滑膜的病变。然后用锐利刀片切取胫骨平台和股骨下髁边缘的软骨组织。1.3.5.3  关节滑液NO的测定 用硝酸还原法，操作按相应试剂盒说明书进行。1.3.5.4  软骨细胞

13、凋亡率分析 将所取软骨组织于含Hank's液的培养皿中反复清洗，清除软骨表面的血液及可能误带的滑膜组织，移入0.2%胶原酶型（0.1 g软骨组织加2 ml含4 mg胶原酶的Hank's液中）小瓶中，用眼科剪剪碎，越细越好，在37水浴中持续轻微搅拌下消化1 h。消化结束后，将含有细胞的酶溶液200目不锈钢筛网进行过滤，1500 r/min离心10 min，弃上清液，调整细胞浓度至1×105/ml。将上述单细胞悬液200目再过滤，取0.1 ml样本至冰浴中，加Annexin -FITC 5l，混匀15 s，加PI染液2.5 l，冰浴中避光反应1520 min，加反应缓冲液0.5 ml，上机检测。2  数据统计应用SPSS11.0软件进行分析。3  结果3.1  关节液中NO的含量结果见表1。表1  各组关节液中NO的水平比较（略）    方差齐性检验，P=0.710，总体方差齐同，ANOV