沙土鼠感染幽门螺杆菌后胃粘膜病理学改变的研究

1、    沙土鼠感染幽门螺杆菌后胃粘膜病理学改变的研究        摘要目的和方法：应用HP标准菌株ATCC43504，增菌培养后接种于6周龄沙土鼠胃内。分别于2周、12周后杀死实验鼠。鼠胃经过福尔马林固定，石蜡切片，进行HP组 化染色、AB/PAS染色及Brdu.PCNA免疫组化染色。结果：接种HP2周后，胃粘膜上皮细胞间 有中性粒细胞、淋巴细胞浸润，上皮细胞及腺窝内可见大量HP存在，AB/PAS染色处见肥大细 胞增多。Brdu.PCNA呈阳性表达，明显高于对照组。接种HP

2、12周后，胃窦部出现溃疡(2/ 3)，胃粘膜上皮细胞可见核分裂相及淋巴滤泡。结论：接种HP2周后的沙土鼠胃粘膜呈 急性炎症改变，HP定植于胃窦粘膜呈慢性炎症改变。提示沙土鼠是研究HP感染性胃病有价值 的动物模型；HP感染性胃粘膜Brdu.PCNA呈阳性高表达，表明HP感染过程中，伴有细胞部 增值性变化。关键词幽门螺杆菌沙土鼠动物模型 Study of Gastric Mucosal Pathology in Mongolian Gerbils Infec ted by Helicobacter PyloriChi Jing， Fu Bao-yu, Jiudao Liangzhi, et alD

3、epartment Gastroentevology, First Clinical College, Chinese Medical Un iversityAbstrect Purpose and methods: This study selected Helicobacter p ylori (HP) standard strain ATCC 43504. After amplification end culture,  the strain was vaccinated to mongolian gerbils with 6 weeks old. Th e animals

4、were killed 2 weeks and 12 weeks later, formaldehyde fixed,  paraffin sectioned brdu PCNA immunchistochemistry stained. Results: 2  weeks after vaccination, neutrophils and lymphocytes infiltrated between   gastric epithelial cells a large number of HP existed in epithelial  cell

5、s and fossa. Mast cells proliferated by AB/PAS staining, positive  expression of Bromodexyuridine (Brdu). PCNA was higher than that of  controls. 12 weeks after vaccination, ulcer appeared in gastrc antrum  (2/3), karyokinesis and lymphocyte follicle could be seen in mucosal e pitheli

6、al cells. Conclusion: Mongolian gerbils appeared acute gastritis  2 weeks after vaccination. HP planted in gastric antrum mucosa. It wa s chronic inflammatory change 12 weeks later which suggested that mong olian gerbils was a valusble animal model for studying HP infection.  For HP infect

7、ed gastric mucosa, Brdu. PCNA positive expression was hig her, it suggested HP infection was accompanied with the change of cel l proliferation.Key word Helicobacter pylori(HP) Mongolian gerbils Animal model1983年由Warren等1从胃粘膜第一次分离出幽门螺杆菌(Hel icobacterpylori，HP)以来，HP研究已引起越来越多学者的重视，对定居于胃内HP的特 性认识更深入。19

8、91年Yokota2、1996年Hirayama3报道了沙土鼠HP感染胃炎、胃溃疡的动物实验。建立动物感染模型，再现同一病变，观察感染后病理的动态变 化及发病机制，进一步了解其在胃内的生存机制及致病性，研究HP感染对胃粘膜向胃癌演进 过程中胃上皮细胞增殖的影响，阐明HP感染在胃癌发生、发展中的作用都具有重要意义。所 以本文建立沙土鼠HP感染模型，以病理学改变为中心，阐述其病理组织学改变。1材料与方法实验动物沙土鼠(Mongoliangerbil)MGS/SEA(SPF)，6周龄，雄性，体重5055g。HP：使用标准菌株ATCC43504(AmericanTissueCultureCollect

9、ion).HP增菌培养后调制成感染菌液2X 108 CFU 0.5 ml，用胃管向绝食24小时的沙土鼠胃内 注入，30分钟以内接种。然后再绝食4小时，连续3天接种，但后2天不绝食。接种前30分钟40%酒精胃管内注入0.5ml。对照组1同样条件下只给培养液，对照组2单纯给予40%酒精。接种后2周、4周、8周、12周、20周分别皮下注射标记细胞周期S期的5-溴脱氧尿核苷(Brom odexyuridine，Brdu)100mg/kg，1小时后杀死沙土鼠，取出全胃，沿大弯切开，暴露胃粘膜，肉眼观察胃粘膜改变，然后分别经过3.5%福尔马林，Carnoy's及MFAA(甲醇、福尔马林，醋酸)及4

10、%多聚甲醛固定，石蜡包埋，制成34m切片。HE染色观察组织病理学改变及炎症细胞浸润情况，Giemsa染色，HP免疫组织化学染色用于 HP判定；Brdu及上皮细胞增殖核抗原(Proliferatingcellnuclearantigen，PCNA) 免疫组织化学染色标记增殖期细胞，标记指数(LI%)。具体免疫组化染色方法：常规脱水脱 蜡，抗原赋活用胰蛋白酶处理10分钟，Brdu染色前用IN盐酸处理，破坏DNA双链结构，3%过 氧化氢加甲醇30分钟阻断内源性过氧化物酶活性，10%的正常羊(兔)血清10分钟阻断非特异 性反应，第一抗体为兔抗人HP抗体，鼠抗Brdu.PCNA抗体(日本DAKO生产)，

11、用LsAB免疫组化方法染色，DAB发色，苏木素染核，脱水，树胶封片。2结果组织学改变：感染早期2周以幽门粘膜为中心的胃粘膜上皮细胞、腺窝上皮细胞间及固有 层中可见以中性粒细胞浸润为主的急性炎性改变，8周以后转变为以淋巴细胞、单核细胞浸 润为主的慢性炎性改变。炎症细胞浸润一般在腺体颈部明显。在炎症部位胃粘膜固有层，淋巴细胞、肥大细胞、单核细胞和嗜酸性粒细胞也和中性粒细胞一样明显增多。炎症细胞浸润 情况另文发表。而且胃粘膜下层血管扩张、水肿，其内皮细胞肿大，炎性细胞浸润随着感染 的持续而逐渐加重，粘膜下层及固有层出现淋巴细胞聚集，形成淋巴滤泡。3个月后在胃窦部及幽门部出现胃溃疡，溃疡累及到肌层，未

12、出现胃溃疡沙土鼠也看到了明显的炎症变化，胃腺窝加深，管腔变大、不规则。上皮细胞核染色质增多，呈现多形性。并可见多数核分裂 相存在。胃小凹上皮细胞变性，过形成及异型性出现。这样炎症性改变在所有试验组沙土鼠 内都能见到。对照组没有HP感染的沙土鼠组，2周后肉眼及组织学无改变。单纯酒精给予组1 个月后胃粘膜糜烂也恢复正常。HE染色、Giemsa染色、HP免疫组织化学染色，在上皮细胞表层粘液及腺窝内可明显看到HP 存在。一部分菌体在粘液凝胶层内成浮游状态，一部分菌体侵入上皮细胞间。菌体量和菌体 的存在部位与细胞损害和炎性细胞浸润的程度有关。Brdu和PCNA染色在粘膜固有层炎症部位可见细胞增殖带增宽，

13、被标识的阳性细胞比正常粘 膜明显增多，而且炎症越重，细胞增殖越明显。提示HP感染胃病，细胞增殖亢进。3讨论众所周知，HP可导致多种胃、十二指肠疾病，是胃炎和十二指肠溃疡的主要致病因素。本 文结果证明HP感染可引起胃粘膜慢性和活动性胃炎及胃溃疡，主要特征为中性粒细胞、淋巴 细胞浸润，粘膜固有层及粘膜下层大量淋巴滤泡形成。引起胃粘膜病变主要以胃窦和胃体为 主，早期以胃窦和幽门部为重，胃体部较轻。而且感染的胃粘膜细胞增殖加快，从细胞动力 学角度探讨HP感染与胃癌发生的关系已成为近年的研究热点。细胞增殖速度的增加被认为是 肿瘤发生的标志之一。在HP相关的慢性胃炎患者中，胃粘膜上皮细胞的增殖和凋亡的速度

14、显 著高于无HP感染者。根除HP后这种增殖和凋亡的速度基本可恢复正常4。提示HP 感染可能在胃癌的发生过程中起着启动因子的作用。治愈HP可能有助于胃癌及癌前病变的预 防。HP感染的胃粘膜病理形态学改变不仅与HP的直接作用及粘膜对菌体抗原的机理反应有关 ，还与HP所致粘膜障碍，粘膜屏障破坏，外来抗原侵入过多有关。目前认为，HP引起胃粘膜 炎症改变，作为致癌因子在起作用。40%酒精的先给予，一般认为能够助长沙土鼠HP接种后 胃粘膜病变的进展，增加胃粘膜对HP的易感性。胃粘膜细胞周转的异常和基因水平的不稳定 性，突变引起的恶变将是今后的重要研究课题。为什么沙土鼠HP感染会引起与人类类似的变 化，HP

15、的长期感染实验及除菌治疗，HP与胃癌的关系研究目前正在继续研究中。作者单位:迟晶傅宝玉中国医科大学第一临床学院消化内科(沈阳110001)九岛亮治服部隆则日本滋贺医科大学病理第一讲座参考文献1 Warren JR, Marshall BJ. Unidentified curved bacilli on gas tric epithelium in active chronic gastritis. Lancet,1983,1273.2 Yokota K, Kurebayashi Y, Takayama Y, et al. Colonization of helic obacter pylori in the gastric mucosa of mongolian gerbils. Microbiol I mmunol,1991,35(6)475-480.3 Hirayama F, Takagi S, Kusuhara M, et al. Induction of gastric ul cer and intestinal metaplasia in mongolian gerbils infected with helico bacter pylori.