牛透明软骨细胞与组织引导再生胶原膜体外培养后植入体内的研究

1、    牛透明软骨细胞与组织引导再生胶原膜 体外培养后植入体内的研究        【摘要】目的解决修复重建组织器官缺损所需移植材料的问题，利用组织工程技术，进行组织工程牛透明软骨的实验研究。方法用分离获得的牛软骨细胞，与医用组织引导再生胶原膜体外联合培养1周后，以软骨细胞可降解材料复合物的形式植入裸鼠体内，8周后对所获得的组织工程软骨样组织进行形态学研究。结果在实验获得的组织工程软骨样组织中有软骨细胞的存在，并且可以分泌硫酸软骨素。证实为组织工程牛透明软骨。结论实

2、验结果表明应用组织工程技术，在体外进行组织工程软骨的制作，可能成为解决整形外科领域修复缺损用移植材料不足的方法之一。【关键词】软骨细胞医用组织引导再生胶原膜体外培养组织工程学 A study on guided tissue regeneration and tissue engineering-transplantation of collagen membrane seeded with cultured hyaline chondrocytesSONG Yeguang, MA Haihuan, CAI Zhe, et al.Plastic Surgery Hospital, Chines

3、e Academy of Medical Sciences, Beijing 100041【Abstract】 Objective Lack of transplant material is a main problem in the repair and reconstruction of tissue or organ defects. To seek the succedaneum of transplants, we studied and used tissue-engineered growth hyaline cartilage.Methods The articular hy

4、aline cartilage obtained from newborn calf within 6 hours of sacrifice was enzymatically dissolved. The chondrocytes were then seeded onto the medical collagen membrane of guided tissue regeneration in a 24 well plate in RPMI1640 medium. One week later, the chondrocyte medical collagen membrane of g

5、uided tissue regeneration complex was implanted subcutaneously into the back of nude mice. Eight weeks after implantation, the animals were sacrificed.Results The present study seems to demonstrate that the cartilage-like tissue was strong enough to be transferred after being implanted for 8 weeks.

6、The cartilage-like tissue was proved to be tissue-engineered hyaline cartilage by HE stain. The chondrocytes could secrete chondroitin sulfate as proved by Lev-Spicer stain. Conclusion Tissue engineering technique was used to make tissue-engineered cartilage in vitro. It will provide a new transplan

7、t material for the repair of tissue or organ defects.【Key words】 Chondrocyte Guided tissue regeneration Culture in vitro Tissue engineering组织移植是整形外科修复和改善缺损组织器官的主要方法之一，但是，自体组织移植来源有限，免疫排斥和免疫抑制剂的副作用限制了异体组织的使用，其它合成及天然材料亦存有各种不足。80年代初组织工程学的开展，为寻求新的组织移植替代物开辟了新途径。我们也尝试利用组织工程技术，进行组织工程软骨的培育，选择细胞易分离、增殖能力强的新生牛透

8、明软骨细胞，与医用组织引导再生胶原膜体外联合培养后，植入裸鼠体内，观察探求用组织工程软骨，解决整形外科领域移植材料不足的可能性。1材料与方法1.1实验材料1.2实验方法16/ml，取1ml软骨细胞悬浮液接种于24孔培养板内的1cm×1cm医用组织引导再生胶原膜上，置37CO22结果2.1软骨细胞培养结果以往软骨组织工程学研究，广泛使用的细胞培养支架为PGA，我们选用中国医学科学院生物医学工程研究所提供的医用组织引导再生胶原膜代替PGA，加入细胞悬浮液后，镜下观察细胞均匀沉降于医用组织引导再生胶原膜表面，随培养时间延长，细胞数量逐渐增多。1周后医用组织引导再生胶原膜可见乳白色物质。2.

9、2大体解剖观察结果移植术后8周，裸鼠皮下可见约0.5cm×1.0 cm大小新生组织块，触之微软有弹性，可随皮肤上下左右移动；解剖见新生组织块为乳白色，组织表面有血管通过，触之有弹性。2.3组织学观察结果利用苏木素-伊红染色，可观察到新生组织内的基质呈碱性，软骨细胞核呈蓝染。其中可见同源软骨细胞，软骨囊不明显(1)。Lev-Spicer染色显示了新生组织中呈蓝染的部分区域(2)，表明软骨细胞可以分泌硫酸软骨素。1组织工程软骨组织的苏木素伊红染色，其中可见同源软骨细胞，软骨囊不明显×400Fig1Photomicrograph demonstration histology,u

10、sing hematoxylin and eosin stain,tissue-engineered cartilage.The specimen is composed chondrocytes and aldaline matrix.Nucli of the chondrocytes are stained in blue color and alkaline matric are stained in pink color×4002组织工程软骨的阿尔新兰染色，组织中呈蓝染的部分为软骨细胞分泌的硫酸软骨素   ×400Fig2Lev-Spicer staini

11、ng of tissue-engineered cartilage.Chondroitin sulfate is stained in blue color×4003讨论组织工程学的开展，为研究修复组织和器官缺损所致的功能障碍开辟了新途径，自从Vacanti等2-4利用组织工程技术成功的再生了新生小牛透明软骨后，组织工程学研究越来越受到国内外学者的重视。国内学者近年来从各个角度进行了研究探讨，刘彦春等5进行了组织工程技术中细胞培养支架的研究，证实以卵磷脂和多聚赖氨酸共同包埋支架，使细胞均匀分布于支架纤维之间和支架表面，可以促进细胞发挥正常功能。王为民等6进行了用动物组织的细胞外基质(

12、Extracellular matrix, ECM)替代人工合成ECM制作的实验，证实经处理后的动物组织仅剩肌腱、皮肤、软骨和骨的胶原框架，动物实验表明兔软骨ECM，可以作为组织填充物而长期存在并有较好的组织亲和性和相容性，可以在体内诱导软骨膜细胞向其中生长而重建软骨。张前法等7进行了兔自体肌腱细胞与碳纤维体外联合培养后的体内植入实验，结果表明体内植入后肌腱细胞继续增殖，并能合成I型胶原。软骨组织是整形外科进行组织修复与重建的理想材料，由于自体软骨供区有限，因此，我们开展软骨组织工程学的实验研究，选用中国医学科学院生物医学工程研究所提供的医用组织引导再生胶原膜作为细胞外基质，其主要材料为动物天然胶原蛋白，具有组织细胞诱导再生作用，其特有的三维网状结构有细胞网结聚集功能。我们的实验结果表明，医用组织引导再生胶原膜可以作为软骨细胞体外培养支架。将新生小牛肱骨关节面的透明软骨细胞-组织引导再生胶原膜复合物，植入裸鼠体内，8周后对从裸鼠体内获得组织工程软骨样组织进行的组织学检测，证实为