皮胶原的提取及胶原基生物膜材料的研究

1、M022 皮胶原的提取及胶原基生物膜材料的研究穆畅道 朱梅湘 林炜（四川大学化工学院制药与生物工程系，成都 610065）摘 要 胶原具有优良的可生物降解性、弱抗原性、止血性、生物相容性等特点，胶原已被认为是最有用的天然生物材料之一。皮胶原的提取方法有多种，论文以酸溶解法，酸溶解加酶处理法提取胶原，对影响提取的主要因素：pH值、酶用量变化进行了研究。提取的胶原样品基本保留了三股螺旋结构，与天然胶原的相符性较好。选用了单宁酸为胶原基膜生物材料交联剂，结果表明，单宁酸交联胶原有较高热稳定性，且抗酶解能力强，生物稳定性好，适于用作生物材料。 关键词 胶原 提取 交联 单宁酸 胶原膜 生物材料EXTR

2、ACT COLLAGEN AND STUDY ONCOLLAGEN-BASED BIOMATERIALSMU changdao, ZHU meixiang and LIN wei(College of Chemical Engineering，Sichuan University，Chengdu 610065，China)Abstract The excellent antigenicity, biocompatibility, degradability and hemostasia ability are the advantages of collagen as biomaterials

3、, due to its special biological structure. It is easily absorbable, nontoxic in the body, and hydrophilic, making collagen the primary resource in medical applications. Collagen can be extracted by several methods. Enzyme dosage, duration and pH variation, the key factors effecting preparation proce

4、ss, were studied. Original triple helix structure were showed well preserved and characteristics of the sample were showed matching the native collagen.Collagen film can get enough tensile strength and biological stability by cross-linking, which is very important for film biomaterials. Tannic acid

5、cross-linked collagen film was suitable for biomaterial dependent on its sufficient degree of cross-linking, low enzymatic degradation rate.Keywords collagen，extraction，cross-linking，tannic acid，collagen film，biomaterial引 言胶原是生物体内一种纤维蛋白，也是一族具有很高抗张强度的硬蛋白质，大量存在于骨、软骨、肌腱及皮肤中，占人体或其他动物体总蛋白含量的25%33%。据估计，自然

6、界从低等的无脊椎动物到高等的哺乳动物，总共大约有500亿吨以上的胶原1。其中型胶原占生物体总胶原量的90%。随着分子生物学、遗传学、材料学、组织工程等学科的迅速发展,胶原的性质和生物学功能逐步被深入认识和了解，其作为天然高分子在生物医学材料等领域的应用也越来越受到重视。尤其在生物医学应用方面，胶原展现了优秀的可生物降解性、弱抗原性、止血性、生物相容性等特点，胶原已被认为是最有用的天然生物材料之一。其中，以膜形式的胶原材料在生物医学领域的应用最为多见，研究的也较多。皮胶原的提取方法有多种，盐法和碱法各有缺点，而酸法和酶法均有优势。论文以酸溶解法，酸溶解加酶处理法提取胶原，对影响提取的主要因素：p

7、H值、酶用量变化进行重点研究。用提取出的胶原样品冷冻干燥成膜，根据生物膜材料的特性要求，论文选用了具有独特和多样的生理、药理活性的单宁酸为交联剂，通过考察交联后胶原膜的热稳定性温度和抗酶降解性，来验证其交联度和生物稳定性。1 实验部分1.1 皮胶原的提取把市场上买的新鲜生猪皮反复清洗，尽可能刮去脂肪组织和结缔组织，将其切成碎块1×1cm2，再用有机溶剂脱脂，于通风橱晾干。称取50g的脱脂干皮，置于小烧杯内。配制不同pH条件下的200ml乙酸溶液，分别倒入小烧杯内。每隔一定时间从冰箱中取出用磁力搅拌器搅拌，并用移液管移取5ml胶原溶出，溶液体液样品，测定其羟脯氨酸含量。以羟脯氨酸含量测

8、定值0换算成胶原含量1（g/l）积为200ml，再与原生皮重量50g相比较，即可得到胶原实际溶出率。溶出率（%）=1×0.2/ 50；1=0/14%。配制不同pH条件下的200ml乙酸溶液，加入50g脱脂干皮和一定量胃蛋白酶的烧杯内，进行溶解。每一组实验变化一次酶用量比例，共分5组，依次为1001（100g皮用1g胃蛋白酶），801，601，401，201。实验过程在冰箱内进行，每隔一定时间取出用磁力搅拌器搅拌，并用移液管移取5ml胶原溶液样品，测定其羟脯氨酸含量。溶出率（%）=1×0.2/ 50 ；1=0/14%。1.2 生物材料用胶原的纯化将溶出物经多层纱布过滤，滤液用

9、高速离心机10000r/min离心20-30min，倾出上清液。以NaOH溶液将上清液调至pH中性，加入固体氯化钠，放置冰箱内盐析，离心得到沉淀物，用酸溶解。再盐析溶解，如此重复2次，得到粗胶原蛋白液。粗液移入透析袋内，对蒸馏水透析，同时加以搅拌，每日更换二次蒸馏水。1.3 胶原膜的交联所有的交联实验都在恒温条件下进行。同等重量的胶原样品成膜后，在不同浓度的五蓓子单宁酸溶液中浸泡交联36hrs，完成后，样品用蒸馏水漂洗，再脱水1hr，室温下干燥。将胶原样品膜放入0.25戊二醛溶液内，浸泡交联36hrs，完成后，样品用蒸馏水漂洗，再脱水1hrs，室温下干燥。1.4 胶原膜对单宁酸的吸收量测定；同

10、取一定量的胶原溶液，同温下干燥成膜，在干燥器内保存2hrs，取出称重W1（g）（g），以W2/ W1一用量胶原溶液得到的交联干燥样品，也在干燥器内保存2hrs，取出称重W2的比值作为胶原样品对单宁酸的吸收率。2 结果与讨论2.1 皮胶原的提取胶原的变性温度在pH中性时为4041，酸性时为3839，因此，在胶原提取过程中，最好置于低温环境下。胶原含量的计算：羟脯氨酸是胶原的特征氨基酸，可根据羟脯氨酸在胶原中的含量比较恒定的特点来估算胶原的含量，如软骨中羟脯氨酸约占软骨胶原的10%2 ，皮肤中的羟脯氨酸约占皮肤胶原总量的14%3。溶出率 （%） 时间 （hr）图1 不同pH条件下胶原溶出率随时间的

11、变化曲线溶出率（%） 时间（hr）图2 pH=1.7时酶用量对胶原溶出率的影响曲线结果表明，当pH=1.72.0内酸溶解法提取胶原时，大部分胶原能在30h内溶出，是50hrs溶出率值的82.7%82.8%，即使再经过20hrs的溶解，溶出率也只能上升16.7%；酸溶解加酶处理法提取胶原，条件控制在pH=1.92.1，酶用量40:1，时间30hrs较为合适。酸溶解+酶处理提取胶原时的溶出率是酸溶解时的3.7倍，酶法更具优势。2.2 纯化胶原的性能表征成年动物皮中8085%是型胶原，10%15%为型胶原。各种胶原具有比较相似的氨基酸组成，即大约30%34%的甘氨酸，脯氨酸和羟脯氨酸总共占20%23

12、%，不含色氨酸，而脯氨酸是胶原特有的氨基酸等4。比较型胶原和猪皮胶原样品的氨基酸组成测定，可看出该样品与型胶原有着非常相似的摩尔组成：其中Gly含量最高，约占氨基酸总和的1/3（型：32.7%和制品：32.06%）；Ala次之，约占1/9（型：11.4%和制品：11.57%）；Pro及HyPro共占约1/5（型：21.6%和制品：18.72%）；不含色氨酸；这4种占氨基酸总和的62%左右。Glu、Asp、Arg、Ser共占氨基酸总和的19%，而His、Tyr、Met、Lys、HyLys等的含量较低，仅含微量的Cys（half）。氨基酸的这种组成形式，非常符合胶原的一级结构特征，表明了样品为胶原

13、。比较猪皮胶原样品在紫外215nm下的色谱流出曲线和Superdex 200 HR 10/30 柱在紫外215nm下的典型色谱测试图，可大致确定样品的分子量Mr160000。在天然状态下，胶原是一个较钢硬的类棒状分子，它是由3个多肽链缠绕成的1个三联超螺旋结构。它变性的结果被打碎成3个多肽链，且呈随机卷曲状态，因此胶原蛋白的热变性过程是在一个窄的温度间隔内其三股螺旋的解缠绕过程。由于胶原被加热时，氢键断裂，导致胶原分子的解缠绕，分子结构从有序态变为无序态、从折叠态变无规卷曲状态，天然构象被破坏，在这些状态的变化过程中都会伴随着能量的变化，这样用DSC来进行测量就可得到其热稳定性信息。图3 猪皮

14、胶原样品的DSC吸收曲线胶原的热稳定性可由纤维的热收缩温度来表达。胶原纤维在温度升高时，会突然收缩发生变性，这一引起胶原收缩变性的温度称为收缩温度。胶原收缩温度因动物种类不同而略有差异，一般为6065。如猪皮收缩温度为66，小牛皮为6365。胶原的热收缩变性与氢键的破坏有关。比较生皮粉和实验样品的DSC曲线图，生皮粉的DSC吸热峰的峰值在65.8，纤维在此点得到最完全的热收缩，即Tm为65.8；纯化后胶原的DSC吸热峰的峰值在63.2，与生皮粉符合地较好。可见实验所得猪皮胶原样品热稳定性与生皮粉相似，与天然胶原的热稳定性接近。这一结果为猪皮胶原样品与天然胶原的相符性验证提供了一个较有力的证据。

15、65.36055504540%T 353417.8430002000cm-1图4 胶原样品和明胶的红外吸收图谱比较根据Payna5等的分析，最重要的氢键是X位（或2位）的羰基C2=O2与另一条链上的NH之间形成的，是参与形成三股螺旋的三股螺旋内氢键，三股螺旋中另外两个羰基C1=O1（一般在Gly上）和C3=O3都朝向三股螺旋的外部，与溶液中的水分子形成氢键。胶原的酰胺A带直接与其超螺旋的三股螺旋构型相关6，其标准状态下在3310 cm-1处呈最大吸收，由于动物的老化会使得A带移向高频，最大幅度可达2530cm-17。所以样品在3325.29 cm-1（与3310 cm-1相距15.29 cm-

16、1）处出现的强吸收峰，就是与三股螺旋构型直接相关的酰胺A带；而从明胶的红外吸收图4可见，明胶酰胺A带明显偏离很远，在3417.84 cm-1处。综上分析，我们能得到这样一个信息，即猪皮胶原样品还保存着较完整的三股螺旋构型，基本保留了天然胶原的原有形态，能为胶原作生物材料应用提供可靠基础，符合本课题目的，并说明了实验方法的可行性。2.3 胶原膜与单宁酸的交联纯化后的胶原可制成许多不同形式的生物医学材料，如膜、带、薄片、海绵、珠体等，但以膜形式应用为主。胶原本身干燥后质地脆，难以成膜，不耐水，潮湿环境中易受细菌侵蚀而变质。若用某些合适的材料如壳聚糖、甘油等与它共混，或者通过化学方法、物理方法、辐射

17、引发、等离子体方法改性，既可避免其缺点，改善胶原的力学性能、抗水性，又可得到由辅助材料补充的特殊功能。胶原制成膜用于生物医学，主要有以下特点：（1）物理方面：抗张强度高，延展性低，易干裂，具有类似真皮的形态结构，透水透气性好；（2）物理化学方面：可进行适度交联，可调节溶（解）胀性，可被组织吸收，可与药物相互作用；（3）生物学方面：弱抗原性，经交联或酶处理可使抗原性进一步降低，可隔离微生物；生物相容性好，有生理活性，如有凝血作用。单宁酸溶液浓度和胶原膜对单宁酸的吸收量关系如图5所示。胶原经交联和干燥，单宁酸的吸收量达到1534%。单宁酸浓度与单宁酸的吸收量之间显示了大致的正比例关系：单宁酸溶液浓

18、度越高，胶原吸收的单宁就越多。单宁被吸收量(%) 单宁酸浓度（g/ml）图5 单宁酸浓度和单宁酸吸收量之间的关系2.4 单宁酸吸收量和胶原热收缩温度之间的关系图6是单宁酸不同浓度下交联的胶原膜的DSC吸收曲线图、单宁酸吸收量和交联后胶原的Tm之间的关系图。从图可知，随着交联剂被胶原的吸收量增加，单宁酸在胶原内被结合的量也有所增加，引起了Tm的提高。总地看来，Tm的升高与吸收量的大小成正比关系：比未交联胶原提高了17.8；而吸收量在25%时，在34%吸收量时，Tm能达到最大值81，Tm只有72.8，提高了9.6；吸收量更低时，Tm变化更小。可见，要想得到有一定改观性能的胶原材料，并不需要使用太高

19、浓度的单宁酸来得到最高的交联度，12.5%左右即可。热收缩温度Ts（）单宁酸被吸收量（wt%）图6 单宁酸被吸收量和交联后胶原热收缩温度之间的关系单宁酸与胶原的反应历程是多酚先通过疏水键向胶原分子表面靠近，多酚分子进入疏水袋，然后以多点氢键结合的形式与之复合或交联8，见图7。因此，经五倍子单宁酸交联后的胶原内部氢键增多，致使该转变温度升高，即Tm越高，交联地越强。图7 戊二醛交联胶原样品DSC测试曲线图65.76055504540%T 35302520151030002000cm-13345.89图8 未交联胶原样品和单宁酸交联胶原样品红外吸收比较图谱交联后的胶原酰胺A带明显移动并变强，说明其

20、N-H伸缩会随着交联的变化而变化，胶原内部氢键增多，结合强度加大。酰胺B带的光谱吸收也显示了由交联引起的胶原的变化。从图8中可看到，交联后的胶原酰胺带峰区依然存在。而原来1741.74 cm-1处的吸收峰明显移向1718.82 cm-1，应该是主链的羰基（C=O）接受了氢键结合后使得振动频率大幅度向低波数移动的缘故。交联后的胶原酰胺带特征光谱在峰频位置和强度上也有显著变化。2.6 胶原膜生物稳定性表征抗张强度的降低是测定胶原被降解程度的一个相对敏感方法9。实验考察了不同交联剂交联的胶原膜被胰蛋白酶降解的过程，用以表征它们的生物稳定性。由图9可知，未交联胶原膜降解迅速，接近40min内即丧失90

21、%左右的抗张强度；戊二醛交联胶原膜在40min左右还保留着50%的抗张强度，临近4hrs酶降解过程结束时，抗张强度明显降低；而单宁酸交联的胶原膜变化不大。降解率T/T0（%） 酶降解时间（min）图9 三种不同胶原膜在胰蛋白酶溶液中的降解率随时间变化曲线图单宁酸属于典型的葡萄糖蓓酰基化合物，其多酚羟基的结构赋予了它一系列独特的化学特性和生理活性，如能与蛋白质、生物碱、多糖结合，使其物理化学行为发生变化。单宁酸与蛋白质结合，能使生物体内的原生质凝固，具有抗病毒和抑制酶活性的效果。因此，单宁酸交联的胶原膜表现出了非常强的抗酶能力，有相当好的生物稳定性。相同处理条件下，戊二醛交联的胶原膜稳定性弱地多

22、，而未交联的胶原膜对酶降解最敏感，基本失去了所有的抗张能力，成为溶化态。因此，经单宁交联后的胶原有极好的抗酶解能力和较高热稳定性。 3 结论通过酸溶解法，酸溶解加酶处理法提取胶原研究，提取的胶原样品基本保留了三股螺旋结构，与天然胶原的相符性较好。选用了单宁酸为胶原基膜生物材料交联剂，可显著提高胶原膜高热稳定性，且抗酶解能力强，生物稳定性好，适于用作生物材料。References1 Reich G. Collagen Report：a Review about the Present State. Leder, 1995,46 (8): 192-1992 Johnson R G. Biochemical analysis of rabbit articlar cartilage using an amino acid anlyzer. Clin Orthopoad & Relat Res, 1980, 148(1-2): 2163 Ligh