聚乳酸膜表面静电自组装单抗与壳聚糖复合膜层的研究

1、聚乳酸膜表面静电自组装单抗与壳聚糖复合膜层的研究摘 要: 本文以聚乳酸（PLA）膜为基底，利用氨解反应及静电层层自组装技术，使抗血小板膜糖蛋白单克隆抗体SZ-21 和壳聚糖交替吸附于膜表面， 形成复合层状结构，并利用扫描电镜、红外光谱检测、接触角检测考察和跟踪组装过程，最后采用血小板黏附实验、溶血率实验以及内皮细胞黏附实验进一步考察复合层的血液相容性和细胞相容性。相关实验结果表明经过氨解反应可以成功将自由氨基接枝于PLA 表面，单克隆抗体药物和壳聚糖能够通过静电层层自组装技术在聚乳酸膜表面构建复合涂层，经过改性后的涂层结构具有良好的血液相容性和细胞相容性。本研究材料可能为新型药物血管支架提供选

2、择。关键词：静电自组装；单抗SZ-21；壳聚糖；聚乳酸1 引言目前针对栓塞性心血管疾病，介入治疗已经成为最主要的治疗手段，药物洗脱支架（DrugEluting Stents,DES）更以其疏通栓塞部分血管，有效防止血管的再狭窄的功能得到广泛应用。但是随着临床数据的积累，药物支架植入后出现支架血栓症，特别是晚期血栓的问题也渐渐显露出来1-6。支架血栓症的发生机理涉及很多影响因素7，在支架植入过程中，高压球囊对血管内皮造成机械性损伤，支架周围血流形成湍流从而改变剪切力，支架作为异物植入，都会造成血小板的粘附，聚集和激活8。血小板的粘附和聚集是形成血管内再狭窄的重要因素之一9。另外，早期支架的药物选

3、择也使得支架在抑制平滑肌细胞增殖和迁移的同时，对内皮细胞的迁移和增殖也起到了抑制作用，延迟了损伤修复的时间10。因此，持续的抗血小板治疗和促进再内皮化是未来药物支架的研究重点。药物支架主要由金属支架基底，聚合物涂层，以及结合的药物三部分组成。在涂层多聚物的选择中，聚乳酸（PLA）以其柔韧性和可降解性从而应用广泛。但聚乳酸也并非完美，其具有疏水性，且表面缺乏生物活性物质，不利于细胞的结合与生长11。在对聚乳酸改性的方法中，静电层层自组装技术以其条件温和，工艺简单，成膜物质丰富越来越得到人们的重视，并且这种方法可以用于任何形状的基底12，这对于具有复杂三维结构的血管支架，有不可代替的意义。血小板糖

4、蛋白ba 受体与纤维蛋白原或者vWF 因子结合是血小板聚集过程中最后的共同途径，抗血小板膜糖蛋白单克隆抗体SZ-21 是一种血小板GPb/a 拮抗剂，它能阻断血小板GPb/a 与纤维蛋白原的结合，从而防止血小板的聚集13。壳聚糖是一种具有良好生物相容性、可降解性及生物学活性的高分子材料，具有选择性组织再生、促进创面愈合、预防组织粘连的作用14、15。另外，已有研究表明，一定浓度的壳聚糖能够抑制平滑肌细胞的增殖，同时促进内皮细胞的生长16，这为壳聚糖在临床用于防治术后再狭窄提供了依据。本文基于以上理论基础，用PLA 薄膜为基底，模拟支架表面喷涂的聚乳酸涂层，首先利用氨解反应使PLA 表面接枝自由

5、氨基，并以其携带正电荷为动力，将单克隆抗体SZ-21和壳聚糖用静电层层自组装的方式交替吸附在膜层表面，形成复合层状结构。并对其进行血液及细胞相容性的检测。2 方法2.1 材料与仪器聚乳酸膜（济南岱罡生物科技有限公司，厚度0.05mm，分子量100 万），壳聚糖（sigma公司,脱乙酰度85%），单抗SZ-21（国产，由江苏血液研究所提供），改良型1640 培养基（HyClone 公司），BSA（solabio 公司，Albumin Bovine V），DAPI 染色液（beyotime 公司），其他试剂均为国产分析纯。紫外分光光度计（Beckman DU800），高速离心机（eppendorf

6、 5804R），离心机（eppendorf 5417R），傅立叶变换红外光谱仪（美国PE Lambda900），扫描电子显微镜（TESCAN VEGA2），接触角测试仪(翰光高科技有限责任公司 台湾)，荧光显微镜（OlympusIX81）。2.2 氨基化膜的制备将聚乳酸膜剪成10mm10mm 的方块，浸入体积比为1:1 的乙醇：水中浸泡2h，以去除表面油脂，用蒸馏水冲洗干净后自然晾干。再将膜置于浓度为6mg/ml 的1，6-己二胺/正丙醇溶液中，于40下反应30 分钟，用大量去离子水充分漂洗，去除残留的己二胺，于30真空干燥箱中干燥至恒重。2.3 氨基化膜的测试与表征分别对未经处理的PLA 膜

7、和氨解反应后的PLA 膜测定傅立叶变换红外吸收光谱（FTIR），了解氨解反应过程对PLA 膜的影响。2.4 生物活性物质的组装血小板膜糖蛋白IIb/IIIa 单克隆抗体SZ-21 的等电点（PI）为8.0 到8.1 左右（中国科学院上海生命科学研究院，蛋白质组学研究分析中心测定）。将氨基化膜于室温下在0.012mol/L 盐酸溶液中酸化15min，以稳定其表面正电荷，用大量三蒸水冲洗以去除表面吸附的盐酸，然后将酸化后的膜在浓度为1mg/ml 的血小板膜糖蛋白IIb/IIIa 单克隆抗体SZ-21 的碳酸盐缓冲溶液(CBS，pH=9)中浸泡1h，先用pH=9 的CBS冲洗，再用三蒸水漂洗，然后浸

8、入到壳聚糖/乙酸溶液中(0.1%(g/ mL) ，0.1 mol/L Hac)浸泡30 分钟，先用0.6%(体积分数)的乙酸溶液漂洗，再用三蒸水漂洗，重复以上步骤数次，制备出组装膜。2.5 组装膜表面的测试与表征将 PLA 膜，氨基化膜，以及组装膜干燥，喷金，用扫描电子显微镜(Scanning ElectronMicroscope，SEM)观察，评价氨解，组装过程对聚乳酸表面形貌的影响。对PLA 膜，氨基化膜，以及组装过程中每个循环的吸附，清洗，干燥后，用淌滴法对膜表面进行静态水接触角分析。仪器所配置的相机将三蒸水滴在材料表面的形状记录，并通过软件进行处理。测试液滴的体积为5L，静置15s 后

9、测定。每个表面取3 个样本，每个样本上选取3 个不同的点测试，取平均值。2.6 血小板粘附实验从家兔耳缘静脉采血并按9:1 的比例加入3.8%的枸橼酸钠，在22下以转速1200r/min离心10min，取上清液，得到富血小板血浆（platelet rich plasma，PRP）。将PRP 分别覆盖在组装前后的膜材料表面，于细胞培养箱中37孵育1 小时。然后用PBS（pH=7.4）清洗样品3 次，在4下用2.5%戊二醛固定12 小时，用50%、75%、85%、95%、100%梯度的乙醇相继脱水15min，冷冻干燥，喷金，用SEM 观察。2.7 溶血率实验将新鲜兔血按9:1 的比例加入3.8%枸

10、橼酸钠配成抗凝血，将试样放入具塞玻璃试管，加生理盐水10ml，在37水浴中预热30min，然后加入0.2ml 抗凝血，轻轻混匀，37水浴保温60min，将管中液体转入15ml 离心管，用高速离心机以转速3000r/min 离心5min。在相同实验条件下，分别用10ml 生理盐水和10ml 蒸馏水加抗凝血0.2ml，作为阴性和阳性对照。吸取离心后的上层清液，测定在545nm 波长处的吸光度值，每种处理设置2 个平行样品，每个样品测3 次，取平均值。计算溶血率，公式如下：%=（Dt-Dnc）100/( Dpc-Dnc) 为溶血率，Dt 为样品吸光度值，Dnc 为阴性对照吸光度值，Dpc 为阳性对照

11、吸光度值。2.8 内皮细胞粘附实验将试样铺平放入灭菌24 孔板，紫外照射过夜，取生长状态良好的人脐静脉内皮细胞（Human umbilical vein endothelial cells，HUVEC），以6104/ml 的密度接种在放有试样的孔中，于37，5%CO2，1640 培养液（含10%胎牛血清）中培养。将试样分别于培养24h和48h 后，先用PBS 漂洗三次，然后用4%多聚甲醛于4下固定10min，再用PBS 洗三次，每次5min，用1%BSA 常温封闭30min，PBS 清洗，用DAPI 染色液室温染色5min，最后用PBS 清洗2 次，样品用荧光显微镜检测。3 结果与分析3.1

12、红外光谱分析（FTIR）由于 PLA分子中存在酯基-COO-，氨解反应时这些酯基可以与己二胺中的一个-NH2反应而断裂形成酰胺键，同时产生一头带-OH 的副产物。清洗掉副产物和游离的己二胺后，得到表面接枝有自由氨基的，即氨基化的PLA 膜。由图1 可看到，以未氨解的PLA 谱图（图中虚线部分）作为参照，氨解后的PLA 膜（图中实线部分）在4000cm-12500cm-1 的特征官能团区的吸收谱带明显增宽，原因是氨解反应产生的酰胺键大多形成氢键，而氢键会在该区域形成较宽的谱带。在1680cm-1 左右，氨解后PLA 膜的谱图上，出现一个弱的吸收峰（图中箭头所指处），这是由-NH-形成的变形振动峰

13、。说明通过氨解反应，氨基被共价键合在PLA 表面。3.2 氨解反应及静电层层组装对PLA 膜表面形貌的影响由图 2 可见，与氨解前的PLA 膜光滑的表面形貌相比，氨解后的PLA 膜发生明显的褶皱现象，粗糙度增大，而在组装10 层单抗SZ-21 和壳聚糖之后，膜表面的细微褶皱基本被覆盖，粗糙度在很大程度上降低。分析原因是在氨解反应过程中，PLA 分子链大量断裂，有一部分形成的较短的一端带氨基的分子重新排列，另一部分则被分解下来，于是材料表面形成空缺和缝隙，以褶皱的形式表现。通过10 层静电组装后，壳聚糖和单抗SZ-21 分子几乎可以完全覆盖基底表面，填补氨解反应在膜层表面形成的空隙和皱褶，使得粗

14、糙的表面变得较为平整（smooth out）。3.3 氨解及组装对PLA 亲疏水性的影响材料表面的静态水接触角是由其亲疏水性和成膜状态决定的。由图3 可见，PLA 的接触角将近90，疏水性较强，这将不利于细胞的粘附和生长。经过氨解反应后，材料表面的接触角显著减小，达到75左右，是因为PLA 表面接枝的自由氨基使材料表面的亲水性增强，且粗糙度的增加也会影响接触角。从第3 层以后是单抗SZ-21 和壳聚糖的交替组装，可以看到接触角的数值呈上下曲折波动的现象，且组装单抗SZ-21 的膜层亲水性要强于组装壳聚糖的膜层。这种接触角交替变化的现象可以说明单抗SZ-21 和壳聚糖已经被层层组装于PLA表面。

15、而且从对数趋势线可以看出，接触角的整体变化呈减小趋势，说明氨解反应及层组装可以有效改善PLA 本身的疏水性，这对于提高PLA 的生物相容性，尤其是促进其表面的内皮化有着积极的意义。3.4 血小板数量及形态分析未改性的PLA 表面粘附有大量血小板，并且几乎所有血小板都有伪足伸出，有不同程度的激活现象，如果这种材料进入人体血液循环系统中，会有发生血栓的危险，组装有单抗SZ-21 和壳聚糖的PLA 表面，血小板数量明显减少，且激活的比例降低，大部分血小板形态圆整，看不到伪足的伸出。这说明组装的单抗SZ-21 和壳聚糖可以有效减少血小板的数量，并且抑制血小板的激活，降低血栓的危险。3.5 不同膜层表面

16、的溶血率测试结果由表 1 可知，未经处理的PLA 的溶血率为3.323%，组装有单抗/壳聚糖复合涂层PLA的溶血率为2.412%，两者均小于5%，满足医学标准所规定的植入物溶血率的要求。但组装有单抗/壳聚糖复合涂层PLA 的溶血率低于未经处理的PLA 的溶血率，且经过SPSS17.0 单因素方差分析ANOVA，两者之间的显著性差异达到0.013（p0.05），说明单抗和壳聚糖的层组装对于PLA 溶血率的改善具有显著的效果。3.6 不同膜层表面的内皮细胞黏附及生长情况图5 HUVEC 细胞在不同膜表面的生长情况(bar=50m，a:聚乳酸，24h；b: 聚乳酸，48h；c: 单抗/壳聚糖复合涂层

17、聚乳酸，24h；d：单抗/壳聚糖复合涂层聚乳酸，48h)材料表面的物理性质及含有的功能基团可以影响细胞在其表面的吸附和生长，由图5可以看出，接种24h 后，未经处理的PLA 膜上的内皮细胞粘附数量较少，而具有单抗/壳聚糖复合涂层的PLA 表面含有生物大分子，细胞粘附数量较大，经过48h 培养后，组装有单抗和壳聚糖的PLA 膜比未处理的PLA 表面的细胞数量多。说明单抗和壳聚糖的组装不仅可以促进内皮细胞的粘附，也有利于内皮细胞的增殖。4 结论本文采用氨解及静电自组装技术，在PLA 表面接枝自由氨基，并以其正电荷为推动力，利用静电层层自组装技术使抗血小板膜糖蛋白单克隆抗体SZ-21 和壳聚糖交替吸

18、附于膜层表面。傅立叶变换红外光谱实验显示氨解反应能够将氨基以共价键合的方式接枝于PLA 表面，SEM 结果显示，氨解后PLA 膜表面呈粗糙化现象，在组装SZ-21 和壳聚糖后，膜表面的粗糙结构被覆盖，重新变得平整。经过氨解及组装过程，PLA 的亲水性显著增强，血小板吸附数量减少，溶血率降低，内皮细胞粘附数量增多，这些表征都有利于支架植入后降低再狭窄率及促进内皮新生的过程，本研究可能为今后研制新型药物血管支架提供选择。参考文献1 Zhang F, Qian J, Ge J. Very late stent thrombosis in late stent malapposition after

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20、rdiology hospital registry J. Am J Cardiol , 2008 ,101 (8) : 1105-1111.4 Jaffe R, Strauss B.H. Late and very late thrombosis of drug-eluting stents: evolving concepts andperspectivesJ. J Am Coll Cardiol , 2007. 50(2): 119-127.5 Maisel W.H. Unanswered questions-drug-eluting stents and the risk of late thrombosisJ. N Engl J Med.,2007, 356(10): 981-984.6 Serruys P.W., Daemen J. Are drug-eluting stents associated with a higher rate of late thrombosis than baremetal stents? Late stent thrombosis: a nui