显微镜的种类及其使用方法

1、常用的几种观察微生物的显微镜普通光学显微镜（重点介绍）暗视野显微镜相差显微镜荧光显微镜电子显微镜（简略介绍）一.普通光学显微镜 光学显微镜是一种精密的光学仪器。当前使用的显微镜由一套透镜配合，因而可选择不同的放大倍数对物体的细微结构进行放大观察。普通光学显微镜通常能将物体放大15002000倍(最大的分辨力为0.2m)。 光学显微镜的基本结构光学显微镜的基本结构 1.目镜：通常由两组透镜组成，上端的一组又称为“接目镜”，下端的则称为“场镜”。两者之间或在场镜的下方装有视场光阑（金属环状装置），经物镜放大后的中间像就落在视场光阑平面上，所以其上可加置目镜测微尺。在目镜上方刻有放大倍数，如10、2

2、0等。按照视场的大小，目镜可分为普通目镜和广角目镜。有些显微镜的目镜上还附有视度调节机构，操作者可以对左右眼分别进行视度调整。另有照相目镜(NFK)可用于拍摄。 2.物镜：由数组透镜组成，安装于转换器上，又称接物镜。通常每台显微镜配备一套不同倍数的物镜，包括：低倍物镜：指16；中倍物镜：指625；高倍物镜：指2563；油浸物镜：指90100。其中油浸物镜使用时需在物镜的下表面和盖玻片的上表面之间填充折射率为1.5左右的液体（如香柏油等），它能显著地提高显微观察的分辨率。其他物镜则直接使用。观察过程中物镜的选择一般遵循由低到高的顺序，因为低倍镜的视野大，便于查找待检的具体部位。显微镜的放大倍数，

3、可粗略显微镜的放大倍数，可粗略视为目镜放大倍数与物镜放视为目镜放大倍数与物镜放大倍数的乘积。大倍数的乘积。 3.聚光器：由聚光透镜和虹彩光圈组成，位于在载物台下方。聚光透镜的功能是将光线聚焦于视场范围内；透镜组下方的虹彩光圈可开大缩小，以控制聚光器的通光范围，调节光的强度，影响成像的分辨力和反差。使用时应根据观察目的，配合光源强度加以调节，得到最佳成像效果。 4.光源：较早的普通光学显微镜借助镜座上的反光镜，将自然光或灯光反射到聚光器透镜的中央作为镜检光源。反光镜是由一平面和另一凹面的镜子组成。不用聚光器或光线较强时用凹面镜，凹面镜能起会聚光线的作用；用聚光器或光较弱时，一般都用平面镜。新近出

4、产的显微镜一般直接在镜座上安装光源，并有电流调节螺旋，用于调节光照强度。光源类型有卤素灯、钨丝灯、汞灯、荧光灯、金属卤化物灯等。显微镜的光源照明方法分为两种：透射型与反射(落射)型。前者是指光源由下而上通过透明的镜检对象；反射型显微镜则是以物镜上方打光到(落射照明)不透明的物体上。 机械部分机械部分： 包括镜座、镜柱、镜壁、镜筒、物镜转换器、载物台和准焦螺包括镜座、镜柱、镜壁、镜筒、物镜转换器、载物台和准焦螺旋等。旋等。 1.镜座：基座部分，用于支持整台显微镜的平稳。 2.镜柱：镜座与镜臂之间的直立短柱，起连接和支持的作用。 3.镜臂：显微镜后方的弓形部分，是移动显微镜时握持的部位。有的显微镜

5、在镜臂与镜柱之间有一活动的倾斜关节，可调节镜筒向后倾斜的角度，便于观察。 4.镜筒：安装在镜臂先端的圆筒状结构，上连目镜，下连接物镜转换器。显微镜的国际标准筒长为160 mm，此数字标在物镜的外壳上。 5.物镜转换器：镜筒下端的可自由旋转的圆盘，用于安装物镜。观察时通过转动转换器来调换不同倍数的物镜。 6.载物台：镜筒下方的平台，中央有一圆形的通光孔。用于放置载玻片。载物台上装有固定标本的弹簧夹，一侧有推进器，可移动标本的位置。有些推动器上还附有刻度，可直接计算标本移动的距离以及确定标本的位置。 7.准焦螺旋：装在镜臂或镜柱上的大小两种螺旋，转动时可使镜筒或载物台上下移动，从而调节成像系统的焦

6、距。大的称为粗准焦螺旋，每转动一圈，镜筒升降10mm；小的为细准焦螺旋，转动一圈可使镜筒仅升降0.1mm。一般在低倍镜下观察物体时，以粗准焦螺旋迅速调节物像，使之位于视野中。在此基础上，或在使用高倍镜时，用细准焦螺旋微调。必须注意，一般显微镜装有左右两套准焦螺旋，作用相同，但切勿两手同时转动两侧的螺旋，防止因双手力量不均产生扭力，导致螺旋滑丝。普通光学显微镜的基本成像原理普通光学显微镜的基本成像原理 光线（反光镜）遮光器通光孔镜检样品（透明）物镜的透镜（第一次放大成倒立实像）镜筒目镜（再次放大成虚像）眼。普通光学显微镜的使用过程普通光学显微镜的使用过程 1.镜检前的准备镜检前的准备室内应清洁而

7、干燥，实验台台面水平，稳固无震动，显微镜附近不应放置腐蚀性的试剂。从显微镜柜或镜箱内取出显微镜时，要用右手紧握镜臂，左手托住镜座，平稳地取出，放置在实验台桌面上，置于操作者左前方，距实验台边缘约10cm，镜臂朝自己，镜筒朝前。实验台右侧放绘图用具。 2.调节光源调节光源 如需利用外置光源，宜采用散射的自然光或柔和的灯光。直射的太阳光会对观察者的眼睛造成伤害。转动转换器，使低倍镜正对通光孔，将聚光器上的虹彩光圈开到最大，观察目镜中视野亮度，同时调节反光镜角度，使光照达到最明亮最均匀。自带光源的显微镜，可通过调节电流旋钮来调节光照的强弱。 3.装置待检玻片装置待检玻片将待观察的样品制作成临时或永久

8、装片，放在载物台上，用弹簧夹固定，有盖玻片的一面朝上。移动推进器，调节待检样品至通光孔的中心。 4.低倍镜观察低倍镜观察将低倍镜对准通光孔，缓缓转动粗准焦螺旋，将物镜与装片的距离调至最近。注意不要压碎盖玻片。通过目镜观察，同时用粗准焦螺旋缓慢调节，直至物像出现，再用细准焦螺旋微调，同时调节光源亮度与虹彩光圈的大小，使物像达到最清晰的程度。并利用推进器把需要进一步放大观察的部分移至视野中央。如果使用双筒目镜，应在观察前先调整双筒距离，使两眼视场合并。 5.高倍镜观察高倍镜观察转动转换器，选择较高倍数的物镜，用细准焦螺旋调节焦距，到物像清晰为止。 6 .油镜观察油镜观察油浸物镜的工作距离（指物镜前

9、透镜的表面到被检物体之间的距离）很短，一般在0.2 mm以内，且一般光学显微镜的油浸物镜没有“弹簧装置”，因此使用油浸物镜时，调焦速度必须放慢，避免压碎玻片，并使物镜受损。（1）在低倍镜下找到观察目标，中、高倍镜下逐步放大，将待观察部位置于视野中央，调节光源和虹彩光圈，使通过聚光器的光亮达到最大。（2）转动粗准焦螺旋，将镜筒上旋（或将载物台下降）约2 cm，加一小滴香柏油于玻片的镜检部位上。（3）将粗准焦螺旋缓缓转回，同时注意从侧面观察，直至油镜浸入油滴，镜头几乎与标本接触。（4）从目镜中观察，用细准焦螺旋微调，直至物象清晰。（5）镜检结束后，将镜头旋离玻片，立即清洁镜头镜头。一般先用擦镜纸擦

10、去镜头上的香柏油滴。再用擦镜纸蘸少许乙醚-酒精混合液（2：3），擦去残留油迹，最后再用干净的擦镜纸擦净（注意向一个方向擦拭）。 7.还原显微镜还原显微镜关闭内置光源并拔下电源插头，或使反光镜与聚光器垂直。旋转物镜转换器，使物镜头呈八字形位置与通光孔相对。再将镜筒与载物台距离调至最近，降下聚光器。罩上防尘罩，将显微镜放回柜内或镜箱中。二.暗视野显微镜特点特点： 暗视野显微镜不具备观察物体内部的细微结构的功能，但可以分辨0.004m以上的微粒的存在和运动。因而常用于观察活细胞的结构和细胞内微粒的运动等。 暗视野显微镜的基本原理是丁达尔效应。丁达尔效应丁达尔效应： 当一束光线透过黑暗的房间，从垂直于

11、入射光的方向可以观察到空气里出现的一条光亮的灰尘“通路”，这种现象即丁达尔效应。 暗视野显微镜在普通的光学显微镜上换装暗视野聚光镜后，由于该聚光器内部抛物面结构的遮挡，照射在待检物体表面的光线不能直接进入物镜和目镜，仅散射光能通过，因而视野是黑暗的。操作者通过目镜观察到的，是检物体的衍射光图像。暗视野显微镜基本使用方法暗视野显微镜基本使用方法 1.安装暗视野聚光器（或用厚实的黑纸片制成遮光板，放在普通显微镜的聚光器下方，也能得到暗视野效果）。 2.选用强光源，一般用显微镜灯照明，以防止直射光线进入物镜。 3.在聚光器和玻片之间加一滴香柏油，避免照明光线于聚光镜上进行全反射，达不到被检物体，而得

12、不到暗视野照明。 4.进行中心调节，即水平移动聚光器，使聚光器的光轴与显微镜的光轴严格位于一直线上。升降聚光器，将聚光镜的焦点（图2中圆锥光束的顶点）对准待检物。 5.选用与聚光器相应的物镜，调节焦距，按普通显微镜的方法操作。三.相差显微镜 相差显微镜是荷兰科学家Zernike于1935年发明的，用于观察未染色标本的显微镜。活细胞和未染色的生物标本，因细胞各部细微结构的折射率和厚度的不同，光波通过时，波长和振幅并不发生变化，仅相位发生变化(振幅差)，这种振幅差人眼无法观察。而相差显微镜通过改变这种相位差，并利用光的衍射和干涉现象，把相差变为振幅差来观察活细胞和未染色的标本。相差显微镜和普通显微

13、镜的区别相差显微镜和普通显微镜的区别:用环状光阑代替可变光阑， 用带相板的物镜代替普通物镜，并带有一个合轴用的望远镜。 相差是指同一光线经过折射率不同的介质其相位发生变化并产生的差异。相位指在某一时间上，光的波动所达到的位置。一般由于被检物体（如不染色的细胞）所能产生的相差太小，肉眼很难分辨，只有在变相差为振幅差（明暗差）之后才能被区分。相差决定于光波所通过介质的折射率之差及其厚度，等于折射率与厚度的乘积之差（即光程之差）。而相差显微镜就是利用被检物的光程之差进行镜检的。与普通显微镜差别：与普通显微镜差别： 相差显微镜有四个特殊结构：相差物镜、具有环状光阑的转盘聚光器、合轴调中望远镜和绿色的滤

14、光片。绿色滤光片作用是：缩小照明光线波长范围，减少由于照明光线的波长不同引起的相位变化。用途：用途： 观察未经染色的标本和活细胞。相位板物镜样本聚光器环形光阑光源相差显微镜不同于普通光学显微镜的相差显微镜不同于普通光学显微镜的4个特殊之处：个特殊之处： 1.环形光阑（annular diaphragm） 位于光源与聚光器之间，作用是使透过聚光器的光线形成空心光锥，焦聚到标本上。 2.相位板（annular phaseplate）在物镜中加了涂有氟化镁的相位板，可将直射光或衍射光的相位推迟1/4。分为两种： （1）A+相板：将直射光推迟1/4，两组光波合轴后光波相加，振幅加大，标本结构比周围介质

15、更加变亮，形成亮反差（或称负反差）。 （2）B+相板：将衍射光推迟1/4，两组光线合轴后光波相减，振幅变小，形成暗反差（或称正反差），结构比周围介质更加变暗。 3.合轴调节望远镜：用于调节环状光阑的像与相板共轭面完全吻合。 4.绿色滤光片用于调整光源的波长。照明光线的波长不同，会引起相位的变化，为了获得良好的相差效果，相差显微镜要求使用波长范围比较窄的单色光，通常是用绿色滤光片来调整。相差显微镜的使用步骤相差显微镜的使用步骤： 1.根据待检标本的性质及要求，挑选适合的相差物镜。 2.将标本玻片放到载物台上，进行光轴中心的调整。 3.使用合轴调节望远镜，调整环状光阑与相板上的共轭面圆环完全重叠吻

16、合后，换回目镜。在观察过程中，每次更换物镜倍数时，必须重新进行环状光阑与相板共轭面圆环吻合的调整。 4.加绿色滤光片，按普通光学显微镜的操作步骤进行观察。四.荧光显微镜荧光显微镜荧光显微镜(Fluorescence microscope) ： 荧光显微镜是以紫外线为光源， 用以照射被检物物体， 使之发出荧光， 然后在显微镜下观察物体的形状及其所在位置。荧光显微镜用于研究细胞内物质的吸收、运输、化学物质的分布及定位等。 细胞中有些物质，如叶绿素等，受紫外线照射后可发荧光；另有一些物质本身虽不能发荧光，但如果用荧光染料或荧光抗体染色后，经紫外线照射亦可发荧光，荧光显微镜就是对这类物质进行定性和定量

17、研究的工具之一。荧光显微镜和普通显微镜的区别：荧光显微镜和普通显微镜的区别： 1.照明方式通常为落射式，即光源通过物镜投射于样品上； 2.光源为紫外光，波长较短，分辨力高于普通显微镜； 3.有两个特殊的滤光片，光源前的用以滤除可见光，目镜和物镜之间的用于滤除紫外线，用以保护人眼。 荧光显微镜也是光学显微镜的一种，主要的区别是二者的激发波长不同。由此决定了荧光显微镜与普通光学显微镜结构和使用方法上的不同。 荧光显微镜是免疫荧光细胞化学的基本工具。它是由光源、滤板系统和光学系统等主要部件组成。是利用一定波长的光激发标本发射荧光，通过物镜和目镜系统放大以观察标本的荧光图像。工作原理工作原理光源光源：

18、 现在多采用200W的超高压汞灯作光源，它是用石英玻璃制作，中间呈球形，内充一定数量的汞，工作时由两个电极间放电，引起水银蒸发，球内气压迅速升高，当水银完全蒸发时，可达5070个标准大气压力，这一过程一般约需515min。超高压汞灯的发光是电极间放电使水银分子不断解离和还原过程中发射光量子的结果。它发射很强的紫外和蓝紫光，足以激发各类荧光物质，因此，为荧光显微镜普遍采用。 超高压汞灯也散发大量热能。因此，灯室必须有良好的散热条件，工作环境温度不宜太高滤色系统滤色系统 滤色系统是荧光显微镜的重要部位，由激发滤板和压制滤板组成。滤板一般都以基本色调命名，前面字母代表色调，后面字母代表玻璃，数字代表

19、型号特点。如德德国产品（Schott）BG12，就是种蓝色玻璃，B是蓝色的第一个字母，G是玻璃的第一个字母；我国产品的名称已统一用拼音字母表示，如相当于BG12的蓝色滤板名为QB24，Q是青色（蓝色）拼音的第一个字母，B是玻璃拼音的第一个字母。1.激发滤板 紫外光激发滤板：此滤板可使400nm以下的紫外光透过，阻挡400nm以上的可见光通过。常用型号为UG-1或UG-5，外加一块BG-38，以除去红色尾波。 紫外蓝光激发滤板：此滤板可使300450nm范围内的光通过。常用型号为ZB-2或ZB-3，外加BG-38。 紫蓝光激发滤板：它可使350490nm的光通过。常用型号为QB24（BG12）。

20、2.压制滤板 紫外光压制滤板：可通过可见光、阻挡紫外光通过。能与UG-1或UG-5组合。常用GG-3K430或GG-6K460。 紫蓝光压制滤板：能通过510nm以上波长的光（绿到红），能与BG-12组合。通常用OG-4K510或OG-1K530。 紫外紫光压制滤板：能通过460nm以上波长的光（蓝到红），可与BG-3组合，常用OG-11K470AK 490，K510反光镜反光镜 反光镜的反光层一般是镀铝的，因为铝对紫外光和可见光的蓝紫区吸收少，反射达90%以上，而银的反射只有70%；一般使用平面反光镜。聚光镜聚光镜 1明视野聚光器 在一般荧光显微镜上多用明视野聚光器，它具有聚光力强，使用方便

21、，特别适于低、中倍放大的标本观察。 2暗视野聚光器 暗视野聚光器在荧光显微镜中的应用日益广泛。因为激发光不直接进入物镜，因而除散射光外，激发光也不进入目镜，可以使用薄的激发滤板，增强激发光的强度，压制滤板也可以很薄，因紫外光激发时，可用无色滤板（不透过紫外）而仍然产生黑暗的背景。从而增强了荧光图像的亮度和反衬度，提高了图像的质量，观察舒适，可能发现亮视野难以分辨的细微荧光颗粒。 3相差荧光聚光器 相差聚光器与相差物镜配合使用，可同时进行相差和荧光联合观察，既能看到荧光图像，又能看到相差图像，有助于荧光的定位准确。一般荧光观察很少需要这种聚光器物镜物镜各种物镜均可应用，但最好用消色差的物镜，因其

22、自体荧光极微且透光性能（波长范围）适合于荧光。由于图像在显微镜视野中的荧光亮度与物镜镜口率的平方成正比，而与其放大倍数成反比，所以为了提高荧光图像的亮度，应使用镜口率大的物镜。尤其在高倍放大 时其影响非常明显。因此对荧光不够强的标本，应使用镜口率大的物镜，配合以尽可能低的目镜（4,5，6.3等）。 目镜目镜在荧光显微镜中多用低倍目镜，如5和6.3。过去多用单筒目镜，因为其亮度比双筒目镜高一倍以上，但目前研究型荧光显微镜多用双筒目镜，观察很方便。 荧光显微镜按照光路原理可分为两种荧光显微镜按照光路原理可分为两种 1.透射式荧光显微镜：较为旧式的荧光显微镜，其激发光源通过聚光镜穿过标本材料来激发荧

23、光。其优点是低倍镜时荧光强，而缺点是随放大倍数增加其荧光减弱。所以它仅适用于观察较大的标本材料。 2.落射式荧光显微镜：激发光从物镜向下落射到标本表面，即用同一物镜作为照明聚光器和收集荧光的物镜(附图1-5)。光路中需加上一个双色束分离器（分色镜），它与光轴呈45角，激发光被反射到物镜中，并聚集在样品上，样品所产生的荧光以及由物镜透镜表面、盖玻片表面反射的激发光同时进入物镜，返回到双色束分离器，使激发光和荧光分开，残余激发光再被阻断滤片吸收。如换用不同的激发滤片双色束分离器阻断滤片的组合插块，可满足不同荧光反应产物的需要。此种荧光显微镜的优点是视野照明均匀，成像清晰，放大倍数愈大荧光愈强。五.

24、电子显微镜电子显微镜电子显微镜是利用高速运动的电子束来代替光波的一种显微镜。光学显微镜下只能清楚地观察大于0.2 m的结构。而小于0.2 m的结构称为亚显微结构（submicroscopic structures）或超微结构（ultramicroscopic structures；ultrastructures）。要想看清这些更为细微的结构，就必须选择波长更短的光源，以提高显微镜的分辨率。电子束的波长要比可见光和紫外光短得多，并且电子束的波长与发射电子束的电压平方根成反比，也就是说电压越高波长越短。因此电子显微镜的分辨率远高于光学显微镜，目前可达0.2 nm，放大倍数可达80万倍。电子显微镜的

25、基本要结构电子显微镜的基本要结构 包括镜筒、真空系统和电源柜三部分。镜筒主要由电子枪、电子透镜、样品架、荧光屏和照相机构等部件，自上而下地装配成一个柱体；真空系统包括机械真空泵、扩散泵和真空阀门三部分，并通过抽气管道与镜筒相联接；电源柜由高压发生器、励磁电流稳流器和各种调节控制单元组成。 电子透镜电子透镜 是电子显微镜镜筒中的关键部件。现代电子显微镜大多采用电磁透镜，由稳定的直流励磁电流通过带极靴的线圈产生的强磁场使电子聚焦。电子枪的作用电子枪的作用 发射并形成速度均匀的电子束，由灯丝（阴极）、栅极和阳极（加速极）构成。阴极管发射的电子通过栅极上的小孔形成射线束，经阳极电压加速后射向聚光镜，起到对电子束加速、加压的作用。使用中加速电压的稳定度要求不低于万分之一。电子显微镜分类电子显微镜分类 电子显微镜按结构和用途可分为透射式电子显微镜、扫描式电子显微镜、反射式电子显微镜和发射式电子显微镜等。其中生物学研究中使用最为广泛的是透射式和扫描式电子显微镜。前者常用于观察那些用普通显微镜所不能分辨的细微物质结构；后者主要用于观察固体表面的形貌。透射式电子显微镜透射式电子显微镜组件：组件：1.电子枪 发射电子，由阴极、栅极、阳极组成。2.聚光透镜 即电子透镜，将电子束聚集，可用于控制照明强度和 孔径角。3.样品室 放置待观察的样品，并装有旋转台，用以改变试样的角