Transwell是检测细胞侵袭能力的检测方法.资料

1、Transwell是检测细胞侵袭能力的检测方法我们所使用的是Chemicon公司的ECM554,基质胶已经包被好了，买来就可以用, 很方便，而且我彳门算过，跟自己买胶来包被价格相差不大。这种胶 4度下很软,37度则 变得比较坚硬，因此用前应先放在培养箱中10分钟作用，使胶完全凝固。该试剂盒对穿过膜的细胞进行荧光染色，再用裂解液裂解细胞后检测荧光值。我们在实际使用的时候对穿过膜的细胞采用1%结晶紫染色，镜下计数细胞数目。结晶紫也可以用33%醋酸溶解，再用酶标仪570nm检测，同样可以反应穿过细胞数因为基质胶的厚度直接影响穿过膜的细胞数，因此建议有条件的话还是买这类 已经铺好胶的试剂盒，比较可靠。

2、说明书该公司网上可以下载，对原理也有比较详细的阐述，可以去查一下。我们做的时候，上室用0.5%BSA的培养液，下室用5%血清的培养液，下室血清的 浓度可根据细胞类型的不同进行调整，如果细胞侵袭能力强，可适当降低血清浓度，否 则可适当提高血清浓度。需要注意的是：1。上室内的细胞数目要适当，过多,穿过膜的细胞会过多过快，如果用计数法的 话将难以计数；最少也要保证在收样的时候，上室内还要有细胞存在。具体细胞密度 需要自己摸索。2。细胞计数的准确性对结果影响很大，各组间最好不要分开计数。尽量用同一 密度的细胞悬液给予不同处理，保证各组细胞量一致3。对细胞的处理不可影响细胞生存。否则难以肯定是细胞量的改

3、变还是侵袭能力改变侵袭小室其实不止是transwell的,其它像Boyden chamber Thincert也挺好用 的。我用过Thincert,个人感觉不错，而且价格便宜，是grelner的，孔径8微米用于24 孔板的一个才45块人民币，而且可以零买，不想transwell,总是一箱一箱的卖，实在是 太贵了！侵袭实验要结合实验目的，不一定非要包被的。下面奉上用Thincert做侵袭实验的步骤(摘自A quantitative cell migration assay using ThinCert? cell culture inserts，大家如需要，可用 google搜之：1. Prep

4、are cell cultures according to standard cell culture procedures2. Starve cells overnight in serum-free medium with 0.2 % BSA3. Harvest cells and wash them twice in PBS4. Resuspend cells in serum-free medium with 0.2 % BSA to an appropriate final cell concentration (e.g. 106/ml5. Place 24 well ThinCe

5、rtTM cell culture inserts in the wells of a CELLSTAR? 24 well cell culture plate6. Add 600 l culture medium with or without chemoattractant to each well of the cell culture plate7. Add 200 l cell suspension to each cell culture insert8. Incubate the cell culture plate for 3-24 h in a cell culture in

6、cubator at 37C and 5 % CO29. Remove the cell culture medium from each well of the cell culture plate and replace it by 450 l serum-free culture medium with 8 M Calcein-AM10. Incubate for 45 min in a cell culture incubator at 37C and 5 % CO211. Remove the culture medium from the cell culture inserts1

7、2. Transfer the cell culture inserts into a freshly prepared 24 well cell culture plate containing 500 l prewarmed Trypsin-EDTA per well13. Incubate for 10 min in a cell culture incubator at 37C and 5 % CO2, ag itate the plate from time to time14. Discard the cell culture inserts and transfer 200 l

8、of the Trypsin-EDTA solution （now containing the migratory cells from each well into a black flat bottom 96 well plate15. Read fluorescence in a fluorescence plate reader at an excitation wavelength of 485 nm and an emission wavelength of 520 nm从第9步开始计数侵袭细胞时，这份说明书用的是荧光标记，但这种方法成本高 而且繁琐。我做的时候改为giemsa染

9、色,发现效果不错，具体如下：9 .侵袭实验完成后，取出小室，用棉签小心将膜上表面的细胞擦拭去除；10 用手术刀片小心沿小室边缘将膜切下；11 .把膜下表面向上放在一个洁净的24孔板的孔中；12 .甲醇:冰醋酸（3:1固定10min后用10%giemsa染色;13 .在显微镜下随机选取5个视野计数细胞（即染成紫红色的点，未着色的多为细 胞碎屑计数并拍照留念Transwell细胞体外侵袭实验概述目的:总结并改进细胞体外侵袭实验的操作经验。方法：采用改进后细胞体外侵 袭实验分别研究不同浓度TNFa刺激下的HCCC29810胆囊癌细胞体外侵袭能力的强弱;粉防己碱对HUVEC人类脐静脉内皮细胞迁移能力的

10、抑制作用；VEGF对人结 肠癌HT229细胞体外侵袭能力的影响。结果：改进后侵袭试验定位准确，结果清晰。 结论:按照作者建议的方法操作，能够缩短实验时间，有助于提高细胞体外侵袭实验的 质量。细胞体外侵袭实验主要应用于各种细胞因子对恶性月中瘤细胞侵袭和转移的影 响及一些抑制血管生成的新药研究，但在具体实验中获得真实、最佳实验结果的图 像,并借以说明问题并非简单。很多研究人员在此方面花费了很多时间和科研经费，从刺激实验用的细胞到苏木素染色，看似简单的实验步骤中有很多环节需要研究者注意.材料与方法1.1Matrigel:Becton Dickinson Compary, - 20 C 保存；Tans

11、well plate:Costar ,USA , # 3422 聚碳酯膜微孔直径为 8 pm;苏木素染液，梯度乙醇，二甲苯溶液。1.2 趋化因子的制备取传代第二天长势良好的NIH3T3细胞，无血清培养基轻柔漂洗两次；加入无血清培养基，37C ,5 %CO2培养24 h48h收集细胞培养上清;4 C,12 000rpm离心,10 min，取上清;0.22 11m膜过滤除菌；分装，在-20 C保存。1.3transwell培养板准备所有操作均需无菌操作。-20C保存的Matrigel在冰上保 2C8c过夜融化。在冰上用预冷的枪头吸取100仙l Matrige加入冰预冷的300 比血清培养基中，充分

12、混均。取上述稀释的 Matrigel 25 加入transwell板上室，覆盖整 个聚碳酯膜,37 ,30 min，使Matrigel聚合成胶。已铺好 Matrigel的transwell培养 板置于37c可保存2周。1.4Matrigel侵袭实验（Matrigel Invasion Assay刺激后的各组细胞用 PBS漂洗3 次。以常规方法用无血清培养基制备单细胞悬液，5 105个细胞/ ml,每组细胞各分为两部分。胎盘兰拒染实验，细胞活力需大于95 %。Transwell培养板上室加入 100仙细胞悬液（5 1处4个并加入无血清培养基200 ul。Transwell培养板下室加入 500小

13、晅化因子,37 C ,5 %CO2培养24 h。用湿棉签轻轻擦去 Matrigel凝胶和聚碳酯 膜上表面的细胞。小心取出上室，用线拴住，并做好标记,用冰预冷的甲醇固定30 min。苏木素染色1 min。梯度乙醇脱水（80 % ,95 % ,100 %二甲苯透明。小心将聚 碳酯膜自上室基底切取下来，置载玻片上中性树脂封片。附着于聚碳酯膜下表面的 细胞在高倍镜下（400随机取6个视野1 计数，取平均数。重复实验两次。注意事项2. 1NIH3T3细胞制备的趋化因子与胎牛血清趋化因子是能使细胞产生趋化运动的一类细胞因子2 。目前利用NIH3T3细胞制备趋化因子做细胞体 外侵袭实验的实验室比较多，时间较

14、长且实验步骤繁琐。众所周知，胎牛血清中有趋化因子，我们在不同浓度TNFa刺激下的HCCC29810胆囊癌细胞 体外侵袭能力的强弱实验中发现用胎牛血清和用NIH3T3细胞制备的趋化因子做细胞体外侵袭实验效果是一样的，两组迁移的细胞数很接近。在实验 时间上用NIH3 T3细胞制备趋化因子做细胞体外侵袭实验周期为1周，而用胎牛血清作趋化因子做细胞体外侵袭实验周期为2d，实验时间节省了很多。因此认为可以用胎牛血清来代替NIH3T3细胞制备的趋化因子。2. 2细胞的准备所需细胞应处在对数生长期，细胞活力需大于95 %。如果细胞 活力小，就会造成细胞穿透能力下降，影响实验结果。2. 3擦去Matrigel

15、凝胶和聚碳酯膜上表面的细胞先用干棉签将上室内液体吸去再用蒸储水浸湿的棉签轻轻擦去 Mat rigel凝胶和聚碳酯膜上表面的细胞，如果没有 擦净聚碳酯膜上表面的细胞，在细胞计数时就会将没擦掉的细胞也计进来。尤其是 细胞为圆形的时候，就会分辨不出是穿过去的细胞还是没穿过去的细胞 ，对于长梭形 细胞来说，穿过去的细胞为长梭形，没穿过去的细胞多为圆形。2. 4苏木素染色上室浸泡在新苏木素中的时间为1 min，用过多次的苏木素为2min。在研究粉防己碱对HUVEC人类脐静脉内皮细胞迁移能力的抑制作用没有将 多余苏木素洗去，直接脱水、透明，造成细胞图片背景模糊，细胞不清楚。在作不同浓 度TNFa刺激下的HCCC29810胆囊癌细胞体外侵袭能力的强弱实验时我们将其置 于盛有自来水的烧杯中，反复漂洗几次，将多余苏木素洗去再行脱水、透明；这样做出 的细胞图片背景干净，细胞清楚。2. 5脱水和透明时间脱水时间各为1 min，在二甲苯中的时间不要过长，以2 min3