基因组学第3章基因组结构的维持

1、第三章 基因组结构的维持与改变基因组结构维持与改变基因组结构维持与改变n基因组的相对稳定(维持)是物种生存的需要：依靠复制（模板依赖性）与修复n基因组改变是进化的基础n基因组改变的类型： 1)突变(mutation) 小范围序列改变 单个或几个核苷酸的替换、插入、缺失 来源于DNA复制错误或诱变破环。 2)重组(recombination) 大范围序列重建 同源重组、位点特异性重组、转座 来源于染色体内或染色体间序列的交换。基因组改变与修复基因组改变与修复主要内容主要内容n基因组复制基因组复制n突变与突变与DNADNA修复修复n重组与转座重组与转座第一节 基因组复制半保留复制与拓扑结构问题半保

2、留复制与拓扑结构问题n1953年，年，Watson&Crick提提出出DNA双螺旋结构双螺旋结构n同年，提出复制的可能方式：同年，提出复制的可能方式： 两条母链均可作为模板来合两条母链均可作为模板来合成新成新DNA链链 半保留复制半保留复制nDNA双螺旋结构的难题双螺旋结构的难题拓拓扑结构问题：扑结构问题： 复制时两条链如何打开？复制时两条链如何打开？ DNADNA复制的三种可能途径复制的三种可能途径半保留复制的实验证明半保留复制的实验证明Meselson-StahlMeselson-Stahl实验（实验（1 1）n在含有在含有15NH4Cl的的培养基中培养大肠培养基中培养大肠杆菌杆菌

3、n将细菌转移到正常将细菌转移到正常培养基（含培养基（含14NH4Cl）n分别于细菌分裂一分别于细菌分裂一次和两次后取样，次和两次后取样，密度梯度离心密度梯度离心半保留复制的实验证明半保留复制的实验证明Meselson-StahlMeselson-Stahl实验（实验（2 2）细胞中必然存在着一种解决拓扑学问题的方法细胞中必然存在着一种解决拓扑学问题的方法拓扑异构酶拓扑异构酶解旋酶解决了拓解旋酶解决了拓扑问题扑问题n催化断裂催化断裂- -再再连接反应的连接反应的酶。酶。n在在DNADNA分子一分子一条或两条链条或两条链上形成切口，上形成切口，通过切口解通过切口解开螺旋。开螺旋。在复制过程中拓扑异

4、构酶解旋在复制过程中拓扑异构酶解旋DNADNA双螺旋双螺旋以半保留模式为主体的不同复制形式替代复制替代复制滚环复制滚环复制复制过程复制过程nDNADNA的复制发生的复制发生在细胞周期的在细胞周期的S S期期n起始起始n延伸延伸n终止终止复制起始复制起始双向复制双向复制n基因组中形成两个基因组中形成两个复制叉（复制眼），复制叉（复制眼），分别以一条链为模分别以一条链为模板，双向复制板，双向复制n每条链复制中，每条链复制中，DNADNA合成方向相同：合成方向相同：5 5到到3 3n两条链复制行进的两条链复制行进的方向相反方向相反基因组结构与复制起点基因组结构与复制起点n复制起始存在着固复制起始存在

5、着固定的位点，复制起定的位点，复制起点点(origin of (origin of replication)replication)n细菌：环形基因组细菌：环形基因组只有单一的复制起只有单一的复制起点点n真核生物：线性基真核生物：线性基因组存在多个复制因组存在多个复制起点起点 酵母：酵母：332332个个 人类：人类：2000020000个个大肠杆菌复制起点大肠杆菌复制起点n复制起点复制起点oriCoriC，长约，长约245bp245bpn2 2个重复基序个重复基序1 1）9 9核苷酸核苷酸5 5拷贝拷贝 DnaA DnaA蛋蛋白结合位点白结合位点 结合结合3030个个DnaADnaA蛋白蛋白

6、2 2）1313核苷酸核苷酸3 3拷贝拷贝 富含富含ATATn几个解旋相关蛋白几个解旋相关蛋白 DnaA, HU, Dna CDnaA, HU, Dna C DnaB DnaB 解旋酶解旋酶酵母复制起点酵母复制起点n自主复制序列自主复制序列ARSARS，不足，不足200bp200bpn含四个具相似序列的亚含四个具相似序列的亚结构域：结构域： A+B1 A+B1 起始识别序列约起始识别序列约40bp40bp，为起始识别复合，为起始识别复合物（物（ORC)ORC)结合部位结合部位 B3 B3与大肠杆菌复制起点与大肠杆菌复制起点相似相似 结合结合ARSARS结合因子结合因子（ABF1)ABF1)，从

7、而使，从而使B2B2的双的双螺旋结构解开螺旋结构解开高等生物复制起点高等生物复制起点n目前仍难以确认目前仍难以确认n将某些复制起始区域转入复制缺陷性质粒后不将某些复制起始区域转入复制缺陷性质粒后不能重建复制能力能重建复制能力n存在酵母存在酵母ORCORC蛋白同源基因蛋白同源基因复制延伸复制延伸n在复制起点形成复制叉在复制起点形成复制叉n母代双链中一条连续复制，称前导链；一条不连续，称滞后母代双链中一条连续复制，称前导链；一条不连续，称滞后链（半不连续）链（半不连续）nDNADNA聚合酶聚合酶n引物引物参与参与DNADNA复制的复制的DNADNA聚合酶聚合酶n细菌5个，其中DNA聚合酶III是复

8、制酶n真核生物9个，其中DNA 聚合酶是复制酶前导链连续合成，后滞链非前导链连续合成，后滞链非连续合成连续合成n合成方向：5到3n滞后链合成中，最初形成一些短的片段，称冈崎片段n细菌冈崎片段长约1000-2000个核苷酸，真核生物的冈崎片段则短得多，少于200个核苷酸n模板依赖性的DNA聚合酶需要引物来启动单链上的DNA合成 非连续合成中的引物与引发酶非连续合成中的引物与引发酶nRNA引物：DNA聚合酶不能作用于无引物的单链模板，而RNA聚合酶可以n细菌中引发酶（primase）合成4-15bp的引物n引发酶不是转录酶细菌和真核生物在细菌和真核生物在DNADNA合成引合成引发中的差异发中的差异

9、 细菌只需引发酶合成RNA引物真核生物由引发酶和DNA聚合酶 形成复合物合成RNA引物和其后的约20个DNA核苷酸大肠杆菌复制需要多种蛋白的大肠杆菌复制需要多种蛋白的协作协作n拓扑异构酶、解旋酶(DnaB)：解旋nDNA聚合酶III：复制n引发酶；提供引物n单链结合蛋白（SSB)：稳定打开的双链 n连接酶：连接冈崎片段n其它蛋白 大肠杆菌复制中解旋酶的作用大肠杆菌复制中解旋酶的作用nDnaB是大肠杆菌中复制相关的主要解旋酶 ，是一种5-3解旋酶n它可以沿后滞链移动，同时使碱基对断裂n另外两种3-5解旋酶：PriA、Repn拓扑异构酶解除解旋所产生的扭转张力大肠杆菌复制中单链结合蛋白大肠杆菌复制

10、中单链结合蛋白的作用的作用n单链结合蛋白（SSB），复制中打开的单链容易重新结合及降解，SSB是一种缺乏酶活性的蛋白，会结合到多聚核苷酸上防止两条链的重新结合及降解。n大肠杆菌SSB是由4个相同的亚基组成。n当复制复合物开始复制时，SSB必须与单链分离，这一作用由复制介导蛋白（replication mediator protein, RMP）来完成。引发小体（引发小体（primosomeprimosome）与复）与复制体（制体（replisomereplisome）n引发小体,复制起始中，解旋酶结合到起点以后形成引发前复合物，然后引发酶结合，形成引发小体。n引物合成后，由DNA聚合酶III二

11、聚体来延伸。nDNA聚合酶III二聚体与引物小体结合称为复制体。大肠杆菌复制中完成滞后链合大肠杆菌复制中完成滞后链合成的方式成的方式n复制酶DNA聚合酶III不具备5-3外切酶活性，到达下一个冈崎片段末端的RNA引物时停止nDNA聚合酶I和RNaseH共同作用去除RNA引物，代之以DNA 真核生物中后滞链合成的方式真核生物中后滞链合成的方式nRNaseH模型：RNaseH去除引物至其最后一个核苷酸，侧翼内切核酸酶(FEN1)去除最后一个核苷酸和部分DNAn侧翼模型：DNA聚合酶和解旋酶使引物与模板间碱基对断开，并被推成分支，再有FEN1切除分支大肠杆菌基因组复制终止大肠杆菌基因组复制终止不允许

12、发生的情况不允许发生的情况n存在终止序列：存在终止序列：TusTus蛋白识别位点蛋白识别位点nTusTus蛋白的不同结合方向控制了复制叉是否能够通过蛋白的不同结合方向控制了复制叉是否能够通过真核生物线性真核生物线性DNADNA分子末端的维持：分子末端的维持：所复制的所复制的DNADNA分子可能变短的问题分子可能变短的问题线性DNA分子的末端变短的原因真核生物真核生物DNADNA末端末端( (端粒端粒) )由端粒酶合成由端粒酶合成人类染色体末端的延伸由端粒酶完成人类染色体末端的延伸由端粒酶完成染色体末端延伸过程的完成染色体末端延伸过程的完成端粒长度和衰老癌症有关Cell：庄小威揭示端粒功能新机制

13、第二节第二节 突变与突变与DNA修复修复复制中的突变复制中的突变n复制中的自发错误复制中的自发错误 尽管尽管DNA聚合酶存在校正能力，聚合酶存在校正能力，但是但突变仍不可避免但是但突变仍不可避免 大肠杆菌的复制错误率大肠杆菌的复制错误率 1/107 ，经修复后基因组复制总错误率降至经修复后基因组复制总错误率降至1/1011-10 n点突变点突变 转换转换 嘌呤到嘌呤或嘧啶到嘧啶嘌呤到嘌呤或嘧啶到嘧啶 颠换颠换 嘌呤到嘧啶或嘧啶到嘌呤嘌呤到嘧啶或嘧啶到嘌呤n插入或缺失插入或缺失 出现在编码区出现在编码区 可能导致移码可能导致移码 其它区域其它区域 可能导致多态性（复制可能导致多态性（复制滑移）滑

14、移） 物理和化学诱变导致突变物理和化学诱变导致突变n化学：化学： 1）碱基类似物替代标准碱基参）碱基类似物替代标准碱基参与复制与复制 5-溴尿嘧啶和溴尿嘧啶和2-氨基嘌呤氨基嘌呤 2）脱氨）脱氨 3）烷化）烷化 4）嵌入）嵌入 溴化乙锭溴化乙锭n物理：物理： 1）紫外辐射）紫外辐射 形成嘧啶二聚体形成嘧啶二聚体 2）电离辐射）电离辐射 3）加热）加热突变可能不影响基因组突变可能不影响基因组n存在很多不影响基因组功能的突变存在很多不影响基因组功能的突变n沉默突变：沉默突变： 1）突变在基因间非调控区域或基因间非编码区域，）突变在基因间非调控区域或基因间非编码区域，对整体基因组功能无影响的突变。可

15、发生在人类基因对整体基因组功能无影响的突变。可发生在人类基因组的组的98.5%。 2）编码区的突变不影响编码蛋白的氨基酸序列，同）编码区的突变不影响编码蛋白的氨基酸序列，同义突变义突变 点突变对基因编码区的四种影响点突变对基因编码区的四种影响n同义：突变后，由同义：突变后，由于密码子兼并性，于密码子兼并性，而不影响所编码的而不影响所编码的氨基酸氨基酸n非同义：引起氨基非同义：引起氨基酸的错误编码酸的错误编码n无义：引起过早终无义：引起过早终止止n通读：引起无法终通读：引起无法终止止编码区的插入或缺失突变可能编码区的插入或缺失突变可能导致不同的影响导致不同的影响n插入或缺失插入或缺失的核苷酸是的

16、核苷酸是3 3的倍数，仅的倍数，仅影响个别氨影响个别氨基酸，因此基酸，因此影响可能较影响可能较小小n非非3 3的倍数，的倍数，将导致移码将导致移码非编码区突变可能影响基因组非编码区突变可能影响基因组的功能的功能n基因表达调控区域的基因表达调控区域的突变：突变： 顺式作用元件，如核顺式作用元件，如核心启动子、关键调节心启动子、关键调节序列序列n内含子剪接位点的突内含子剪接位点的突变：变： 如如5 5剪接点剪接点DNADNA聚合酶确保聚合酶确保DNADNA复制精确性复制精确性的机制的机制n核苷酸选择核苷酸选择 聚合前选择正确的聚合前选择正确的核苷酸核苷酸n校对校对 3 3到到5 5外切酶活性，外切

17、酶活性，聚合后切除错配的聚合后切除错配的核苷酸核苷酸四类四类DNADNA修复系统修复系统n直接修复直接修复 n切除修复切除修复 针对诱变损伤针对诱变损伤n错配修复错配修复 针对复制错误针对复制错误n重组修复重组修复人类人类DNADNA修复修复基因基因切除修复切除修复n主要修复系统，人类参与主要修复系统，人类参与蛋白最多的修复系统蛋白最多的修复系统n碱基切除碱基切除 单核苷酸切除单核苷酸切除 1515个基因参与个基因参与n核苷酸切除核苷酸切除 一段核苷酸一段核苷酸切除切除 28 28个基因参与个基因参与碱基切碱基切除修复除修复nDNADNA糖基化酶糖基化酶 切除碱基，产生切除碱基，产生无碱基（无

18、碱基（APAP）位）位点点nAPAP内切核酸酶内切核酸酶 产生单核苷酸切产生单核苷酸切口口nDNADNA聚合酶聚合酶 填补碱基填补碱基nDNADNA连接酶连接酶 连接断裂连接断裂核苷酸切除与核苷酸切除与UvrABUvrAB修复系统修复系统错配修复中子代错配修复中子代DNADNA的识别的识别n针对复制错误，所以发针对复制错误，所以发生与子代生与子代DNADNA分子分子n一个问题：如何区分子一个问题：如何区分子代代DNADNA分子分子? ?n大肠杆菌中子代新生分大肠杆菌中子代新生分子尚未甲基化，从而可子尚未甲基化，从而可以区分以区分n甲基化位点：甲基化位点： 5 5-GATC-3-GATC-3 A

19、 A甲基化甲基化 5 5-CCA/TGG-3-CCA/TGG-3 C C甲基化甲基化错配错配修复修复与与MutMut修复修复系统系统双链断双链断裂修复裂修复n比单链损伤严重比单链损伤严重n可能由电离辐射可能由电离辐射和化学诱变产生和化学诱变产生n也可能由重组产也可能由重组产生生n也称为重组修复也称为重组修复SOSSOS应答应答n回避是生存的一回避是生存的一种方式种方式n修复难以进行时修复难以进行时 绕过主要损伤位绕过主要损伤位点，允许某些复点，允许某些复制错误保留，继制错误保留，继续复制续复制第三节第三节 重组与转座重组与转座重组与进化重组与进化n重组，各种包括多聚核苷酸断裂和再连接的过程。n

20、没有遗传重组就没有进化n重组使不利和有利的突变得以分离，使适者生存，因此是自然选择的遗传学基础。n重组的一般类型-同源重组（一般性重组）n位点特异性重组（同源区很短）n转座同源重组（同源重组（Homologous Homologous recombinationrecombination）n同源重组，也叫一般性重组（general recombination）,发生在具有高度序列同源性的DNA片段之间。这些片段可处在不同染色体上，也可以是同一染色体的不同部分。n真核生物中，发生于减数分裂时期，负责减数分裂中的互换。同源重组的同源重组的HollidayHolliday模型模型n交换n连接n分支迁

21、移n断裂nHolliday结构分离重组是由于异源双链体重组是由于异源双链体DNADNA间发生断裂与重连间发生断裂与重连n两条双链DNA分子间的重组关键是单链的交换n交换产生异源双链体DNA片段n当双链体DNA的单链与相对应的另一双链体中的单链发生置换时，会产生一个分叉结构（Holliday结构）n分叉迁移使交叉点移动，封闭切口n两次（相互的）交换才能产生一个联合分子n联合分子可以通过切开相接的链来形成两条分开的双链体分子HollidayHolliday结构与重组体的形成结构与重组体的形成n重组体是否形成取决于重组体是否形成取决于参与交换的链在解离过参与交换的链在解离过程中是否被切开程中是否被切

22、开n切开，则水平分离，基切开，则水平分离，基因组不是重组体，但包因组不是重组体，但包含异源双链体含异源双链体DNADNAn不切开，则垂直分离，不切开，则垂直分离，产生互相重组的基因组产生互相重组的基因组HollidayHolliday模型的缺陷与模型的缺陷与Meselson-RaddingMeselson-Radding修正模式修正模式nHolliday模型的缺陷：切口是如何出现在两条分子的同一位置的？n单分子切口n切口链侵入未打开的双螺旋，形成D-环n被取代链断开，形成另一个分子上的切口n修正：在两分子切口形成过程中引入交换的D环大肠杆菌重组系统：大肠杆菌重组系统：1 1）RecBCDRec

23、BCD形成单链形成单链切口切口 nRecBCDRecBCD具有核酸内切酶活性和具有核酸内切酶活性和解旋酶活性解旋酶活性n内切酶：于内切酶：于ChiChi位点切开单链位点切开单链 chi chi位点位点 5 5-GCTGGTGG-3-GCTGGTGG-3n解旋酶：使单链末端游离解旋酶：使单链末端游离大肠杆菌重组大肠杆菌重组系统系统2)2)nRecA RecA 链交换链交换nDNADNA聚合酶聚合酶 填补间隙填补间隙nRuvA,B RuvA,B 分叉迁移分叉迁移nRuvC RuvC 切除切除HollidayHolliday连接点连接点HollidayHolliday模型修正后无法解释模型修正后无法

24、解释基因转换基因转换n配子（配子（AA)XAA)X配子（配子（aa)aa)n合子（合子（AAaa)AAaa)n单倍体孢子（单倍体孢子（A A或或a)a)n正常情况：正常情况：A/a=1/1A/a=1/1n基因转换：基因转换：A/aA/a不不=1/1=1/1双链断裂模型双链断裂模型n单分子双链断裂单分子双链断裂n外切酶使断裂扩大外切酶使断裂扩大n一个一个3 3端侵入未打开端侵入未打开的双螺旋，形成的双螺旋，形成D-D-环环n另一个另一个3 3端链延伸端链延伸n相互移动形成双交换，相互移动形成双交换，即形成两个即形成两个HollidayHolliday结构结构两个两个HollidayHolliday结构的解离可以结构的解离可以解释基因转换解释基因转换位点特异性重组（位点特异性重组（site-site-specific recombinationspecific recombination）n同源重组是发生于两