猪粪和土壤样品中微生物DNA提取方法的比较

1、塑畜塑兽医学会家畜生态学分会年学术会议论文集三堕猪粪和土壤样品中微生物提取方法的比较吴银宝史金才蓝小花陈文燕（华南农业大学动物科学学院，广州）摘要随着规模化养猪业的迅猛发展，猪场的粪污排放量急剧增加，在一定程度上对土壤微生物多样性造成影响为了可以选用同一种提取方法研究猪粪对土壤微生物的影响，本文选用了化学裂解法和试剂盒法从土壤样品和猪粪样品中提取微生物的总，并对这两种方法提取的效果进行比较，以评价这两种方法的有效性结果表明，试剂盒法无法用于提取土壤中的微生物；可以从猪粪中提取到，扩增能得到目的产物，但重复性不高化学裂解法处理土壤样品，提取的浓度高但纯度低，纯化后土壤样品的损失程度不同，但纯度有

2、所增加，为后续的反应提供了浓度较高的微生物样品模板，扩增结果重复性不高；处理猪粪样品，提取的浓度较低但纯度比较高，扩增结果比较理想由此可见，化学裂解法用来提取猪粪样品中的微生物是可行的，但需寻求更好的土壤样品微生物提取办法关键词猪粪；土壤；提取；微生物多样性自上世纪八十年代以来，我国畜牧业特别是养猪业迅猛发展，规模化养猪业在提高生产效率的同时，猪粪、污水排放量急剧增加，给畜牧场环境卫生带来极大的困难，成为环境中重要的污染源之一。另外，在猪日粮中添加的抗生素、重金属、微量元素、激素、镇静剂或兴奋剂等，以及滥用违禁兽药和超量用药，都会增加猪粪尿等排泄物对环境生物的威胁程度。目前对猪粪的处理以利用为

3、主，即与种植业相结合作为有机肥或将其作为鱼的饵料，这就可能导致土壤中微生物种类及数量发生变化。同时有研究表明，自然环境中微生物物种问经常发生基因及质粒等遗传因子的水平转移，转移的基因可与宿主基因重组形成具有特异功能的优势微生物类群，以适应改变了的环境【一，而且还可将这种优势的微生物类群从环境中分离、纯化，应用于污染环境的生物修复工程【列。因此在土壤中长期施用猪粪，会对土壤微生物多样性造成何种变化，这种变化会不会影响陆生生态系统的基本功能，都值得人们去研究和探讨。目前常采用分子生物学技术进行微生物多样性的研究，这些技术的前提是要获得高浓度、大片断、多样性程度高、具有代表性的微生物，因此提取微生物

4、在研究中就显的尤为重要刮。已报道的分别从土壤和猪粪样品中提取的方法有很多种，前者有张瑞福等【】的高盐抽提法、陈敏的冻融一溶菌酶结合法、黄婷婷等阴的间接法等；后者有黄俊文的小珠撞击法和酶解法，刘健华【】等的珠磨法、冻融研磨法和酶法等，另外一些大型生物公司还分别研发出了土壤提取和猪粪提取的商业试剂盒。本文采用两种提取方法对土壤和猪粪的微生物总进行了提取，采用技术扩增提取中的细菌片断，以综合评价这两种方法对土壤和猪粪微生物的提取效果。材料与方法实验材料本实验所用的实验样品采自东莞某猪场，具体情况如表所示。【基金项目】华南农业大学校长基金资助项目作者简介】吴银宝（。），男，博士，主要从事家畜生态学研究

5、。蚴。中国畜牧兽医学会家畜生态学分会年学术会议论文集表实验所用样品样品代号采集方法号样号样号样号样号样随机在猪舍周围空地采集表层土壤（）采集施用过猪粪的菜地表层土壤（）在猪场水塘周围每个水样采集点附近采集淤泥在粪污处理池周围采集固液分离后的粪渣在肉猪舍里面采集猪粪药品与试剂磷酸盐、乙二胺四乙酸（）、三（羟甲基）氨基甲烷（，）（）、十六烷基三乙基溴化铵（）、（氯化钠）、蛋白酶（）、氯仿、冰无水乙醇、双蒸水、缓冲液、超纯水等；的：先将用水加热助溶，边加边搅拌，加几滴盐酸调值至，定容至升；提取缓冲液：配比为磷酸盐（），（），：玻璃珠胶回收试剂盒（产品号：）：上海生工生物工程技术服务有限公司；柱离心式

6、环境样品抽提试剂盒（厂）：上海申能生物工程技术服务有限公司；、引物和（见表）、聚合酶、缓冲液（为）。表用于，的引物注：引物由上海基康生物工程公司合成试验方法与步骤猪粪和土壤微生物的提取化学裂解法：采用略加修改后化学裂解法羽直接从土壤和猪粪样品中提取基因组。称取土壤（猪粪）样品，放在小三角瓶中，加入提取缓冲液和蛋白酶（）。下振荡后，加入的，水浴，水浴过程中每摇匀一次。将上述样品处理液转移到的离心管中，以（）离心后收集上清液，加入：的氯仿抽提上清液，）离心后在上清液中加入：的预冷的无水乙醇过夜沉淀，（）离心，用双蒸水或缓冲液溶解沉淀即为所得的基因组粗提液。试剂盒法：取动物粪便（土壤），用柱离心式环

7、境样品抽提试剂盒，按照操作说明抽提样品基因组。土壤样品微生物基因组纯化采用上海生工产的玻璃珠胶回收试剂盒（产品号：），按照操作说明对其进行纯化。浓度的测定粗提液用紫外分光光度计测和的值，确定各个样品的含量和纯中国畜牧兽医学会家畜生态学分会年学术会议论文集度，按需加超纯水，保证每个样品的浓度一致。扩增山扩增反应体系包括：山（），山缓冲液（为），引物，不同用量的模板（分别为，与止）和（相当于，）聚合酶。反应参数：预变性；交性；退火；延伸；个循环，最后延伸。产物用琼脂糖凝胶电泳鉴定，成像后以为标准。结果分析两种方法提取样品微生物的效果猪粪和土壤样品微生物的提取结果见表和表。结果表明，化学裂解法提取的

8、浓度比试剂盒法的高，说明采用化学裂解法裂解土壤和猪粪样品可以获得浓度较高的。用试剂盒法提取的号土壤样品的浓度均为，说明试剂盒法无法提取出土壤样品中的，处理猪粪样品的效果也不明显（表）。从表还可以看出，化学裂解法提取土壤的浓度要比提取的猪粪中的浓度高。表两种方法提取样品的浓度（）由于蛋白质在处有吸收峰，计算的比值可以确定所提的中蛋白质的污染程度，比值越大，越纯，反之，比值越低，蛋白质污染越严重【。纯度检测结果表明（见表），两种方法提取的猪粪纯度均比较高，但所提取的徊值低于，表明还是受到了蛋白质的污染，而用化学裂解法提取的土壤纯度相对较低。纯化是获取高纯度微生物总的关键步骤。本研究采用玻璃珠胶回收

9、试剂盒对提取的进行纯化，从表和表可以看到，纯化后浓度除号猪粪样品外均大幅度降低，中国畜牧兽医学会家畜生态学分会年学术会议论文集而、和号样品的纯度有所提高，号样品的纯度下降，而号样品纯化后全部损失。扩增结果两种方法提取的电泳图见图和图，由于所提杂质比较多，结果不是很理想（见表），其具体原因分析见表。 图化学裂解法提取纯化后结果和、和、和、和、和分别对应、号样品 图化学裂解法（未纯化）和试剂盒法提取样品的结果为化学裂解法初提未纯化样品的电泳图为试剂盒法提取样品的电泳图和、和、和、和、和分别对应、号样品和、和、和、和、和分别对应、号样品表两种提取方法电泳图的分析结果中国畜牧兽医学会家畜生态学分会年学

10、术会议论文集表结果原因分析讨论微生物提取方法的有效性从角度分析土壤和猪粪样品的微生物多样性，关键在于的提取。的提取方法很多，主要包括物理、化学和酶促等方法。判断所提取的有效性主要根据几个指标来评价，如细胞的裂解效率、得率、纯度和的大小等【本研究采用了浓度和纯度这个指标来评价化学裂解法和试剂盒法这两种提取方法的有效性。微生物的浓度和纯度受地理位置、操作系统、实验方法等多种因素影响，其中细胞裂解方法和缓冲液这两种因素的影响最为重要。常用的细胞裂解法可分为物理法、化学法和酶法，这几种方法可以根据具体情况搭配使用。有研究表明，单纯使用一种细胞裂解方法，很难得到令人十分满意的效果，适当的组合使用可获得高

11、质量的【。本实验所用的化学裂解法，将酶法和物理法结合来裂解微生物的，而试剂盒法仅仅用石英沙振荡裂解，所以化学裂解法的裂解效果比较好。纯化及扩增土壤有机质中含有腐殖酸，由于它的分子大小和理化性质与相似，所以从土壤中提取的微生物总中往往伴有腐殖酸的污染。而腐殖酸对后续的分子生物学操作，如扩增有很大的影响，即使少量的腐殖酸都会抑制扩增反应，使反应得不到任何产物。因此，在反应之前，必须对土壤样品的基因组粗提液进行纯化【】。本研究采用上海生工的玻璃珠胶回收试剂盒对土壤样品的基因组粗提液进行了纯化，虽然纯化后每种样品的产量损失程度不一，但纯化后的样品的腐殖质等反应抑制剂的含量有所降低（纯化后纯度增大），从

12、而为后续的反应提供了浓度较高的基因组样品模板，但结果并不是很理想。结论化学裂解法处理土壤样品，提取的微生物浓度高但纯度低，纯化后进行扩增时结果不理想；处理猪粪样品，提取的浓度低但纯度高，扩增结果比较理想，可见，化学裂解法可用于提取猪粪样品中的微生物。 中国畜牧兽医学会家畜生态学分会年学术会议论文集 试剂盒法不能提取土壤样品中的微生物；提取的猪粪样品的微生物浓度较低，但能 进行扩增。 参考文献 【】 ， ： 。，： 【】张惠文，张倩茹，周启星等分子微生物生态学及其研究进展应用生态学报，（）： 】 ， ， （）： ， ， ， ： ： 【】 ， ， ， ，（）： 【】 ， ， ： 。，（）： 【张瑞福，曹慧，崔中利等土壤微生物总的提取和纯化微生物学报，（）： 【】陈敏土壤样品中提取方法的比较微生物学杂志，。（）： 【】黄婷婷，曹慧，王兴祥等一种土壤微生物总的高效提取方法土壤，（）： 【】黄俊文甘露寡糖对仔猪生长、免疫和肠道微生态的影响华南农业大学博士学位论文， 【刘健华，陈杖榴，李云等肠道菌群多样性变性梯度凝胶电泳分析法的建立中国兽医科技，（）： 【罗海