石油污染黄土土壤的微生物修复实验研究

1、第6卷第6期2008年12月南水北调与水利科技收稿日期:2008211203修回日期:2008211204基金项目:科技部国际合作项目资助“鄂尔多斯盆地能源开发与环境互馈效应研究”(2005DFA90200 作者简介:张胜(19562 , 男, 江苏人, 副研究员, 主要从事微生物地球化学及环境地质等方面的研究。石油污染黄土土壤的微生物修复实验研究张胜1, 陈立1, 毕二平2, 崔晓梅3, 张翠云1, 韩占涛1, 石迎春1, 张发旺1, 何泽1(1. 中国地质科学院水文地质环境地质研究所, 石家庄050061; 2. 中国地质大学(北京 水资源与环境学院, 北京100083;3. 中国地质科学

2、院, 北京100037摘要:为了修复西北黄土区石油污染土壤, 利用优化原位土著微生物菌群辅以物理和化学相结合的修复技术, 在野外调查取样的基础上, 进行了土壤中石油污染的室内模拟降解实验。、25、30、35, 添加了氮、磷、镁、铁等元素和茅草类添加剂, 适时补充氧气等79510mg/kg 、145110mg/kg 、179010mg/kg 、278010mg/kg 时, d , 土壤中石油含量降解率可达77127%89106%, 。关键词:石油污染; ; 中图分类号:X172文章编号:167221683(2008 0620061203Experimental Study on Microbia

3、l R emediation for Oil Contaminated Soil in Loess R egionZHAN G Sheng 1,CH EN Li 1,BI Er 2ping 2,CU I Xiao 2mei 3,ZHAN G Cui 2yun 1, HAN Zhan 2tao 1,SHI Y ing 2chun 1,ZHAN G Fa 2wang 1, H E Ze 1(1. I nstit ute of H y d rogeolog y and Envi ronmental Geolog y , CA GS , S hi j iaz huang 050061, China;2

4、. School of W ater Resources &Envi ronment , China Universit y of Geosciences , Bei j ing 100083, China;3. Chinese A cadem y of Geological S ciences , Bei j ing 100037, China Abstract :In order to remediate oil contaminated soil in loess region of Nort h Shaanxi Province , experimental studies o

5、n degradation of oil polluted soil were carried out using remediation techniques of optimized in 2situ native microbial communities combined wit h physical chemistry met hods. on t he basis of field survey and sampling , t he indoor simulative degradation experiment s of oil polluted soil were proce

6、ssed , In t he experiment s , different temperatures (20, 25, 30, 35were investigated , nitrogen , phosphorus , magnesium , iron and ot her element s , Grass 2type ad 2ditives and oxygen were timely added. The result s of t he experiment showed t hat degradation rate can reach 77127%89106%for oil co

7、ntent s of 79510mg/kg , 145110mg/kg , 179010mg/kg and 278010mg/kg in polluted soil after 3045d microbial degradation. which provide met hods and feasibility of application for microbial remediation of oil contaminated soil in loess region. K ey w ords :oil contamination ;microbial remediation ;soil

8、in loess region1前言我国西北黄土高原地区由于石油资源的大量开采利用, 产生了许多环境问题。尤其是落地原油的污染已影响土壤的质量安全, 土壤石油污染的防治研究工作已受到人们的重视。Jorgensen 的试验显示, 经生物堆埋, 石油污染的土壤中石油可降低71%1。微生物修复技术主要机理是石油烃直接参与了微生物的生化反应, 通过代谢作用降解土壤中的污染物2。土壤微生物修复技术的开发与研究已受到国内外学者的广泛关注3212。目前已知能降解石油中各种烃类的微生物共有约100余属200多种, 它们分属于细菌、放线菌、霉菌、酵母以及藻类13。本文利用优化土著微生物菌群辅以物理和化学方法相结

9、合的综合修复技术, 进行模拟实验, 取得了较好效果。该方法具有处理方法简单、费用低、修复效果好、对环境影响小、无二次污染、可原位治理等优点。因此, 本项研究是在研究区野外调查、取样分析的基础上, 通过室内实验研究为该技术的应用提供了技术支撑, 具有重要的实际意义。2实验材料和方法2. 1实验材料化学试剂:MgSO 4. 7H 2O 、N H 4NO 3、CaCl 2、FeCl 3、KH 2PO 4、K 2HPO 4、KCl 、(N H 4 2SO 4、CaCO 3、NaCl 、可溶性淀粉、蔗糖、乳酸、盐酸、琼脂、液体石蜡、石油醚、三氯甲烷等均为分析纯。原油:为陕西延安杏子川油田地下2400m

10、采出的原油。其它实验材料:新鲜马铃薯、杏子川油田区石油污染黄土土样等。添加剂:草坪草(茅草类 晾干粉碎(510mm 等。实验用土壤样品采自陕西省延安市南约5km210国道边, 山坡上的剖面为黄土土壤, 采样时剖开表层约25cm 的表层土, 取里面新鲜土壤, 为无石油污染样品。土中含有少量25mm 的小姜石, 土壤湿容重为1171193g/cm 3; 土壤干容重为1149117g/cm 3。自然含水量9146%;p H 为811。实验用玻璃器皿等:150mL 、250mL , mL 、1000mL , 管、培养皿、橡胶塞等主要仪器:QZD21、KQ218超声波清洗器、生物恒温培养箱、高速离心机、

11、高压蒸汽灭菌器、无菌实验室、生化培养箱、HZ150L 恒温摇床培养箱、莱卡生物显微镜、752N 紫外可见光栅分光光度计、电热干燥箱及各种化学分析用玻璃仪器。2. 2测试方法石油分析测试方法:采用紫外分光光度法, 该法是国标G B/T57501722006中介绍的紫外分光光度分析法, 该法最低检测质量为5g , 则最低检测质量浓度为01005mg/L 。降解石油微生物细菌培养优选方法:土壤微生物细菌培养用土壤微生物研究法14, 和参考文献14216介绍的方法, 细菌初步鉴定用常见细菌系统鉴定手册17中的方法。2. 3实验步骤2. 3. 1石油降解菌的分离与优选众所周知, 自然界的物质循环微生物细

12、菌的作用是非常重要的一环, 碳的循环也不例外, 许多细菌就是碳循环的主要因子之一。石油降解机理就是在细菌的作用下, 将碳氢化合物降解为CO 2和H 2O 的整个过程, 也是自然界对石油污染的自净功能的生态效应, 对土壤和地下水环境保护具有一定的实际意义。据此用细菌的选择性培养基和富集培养基, 对研究区石油污染土壤的样品进行菌种、菌群的培养分离, 选择优化出实验用降解土壤石油的菌种、菌群。本次试验选择优化出的细菌初步鉴定主要为:假单胞菌属、微球菌属、放线菌属、真菌类(青霉、毛霉、曲霉 等菌群。2. 3. 2土壤石油污染降解实验步骤根据实验选出降解石油污染的优势菌群, 利用不同的培养基对所选出各类

13、菌群进行放大培养。各类菌群培养35d 后进行混合培养, 继续培养37d 后作为相应的石油烃降解实验用菌剂。进行模拟不同温度条件下黄土土壤石油污染的微生物修复实验。实验装置为150mL 三角瓶和具塞三角瓶。黄土土壤石油污染微生物降解模拟实验, 用若干(按实验设计的数量 150mL 三角瓶(第一次实验用 和具塞三角瓶(第二次实验用 每个瓶中加入10g 无菌风干土壤, 加入一定量的原油, 原油的加入方法:将野外取回的原油, 用石油醚(沸点6090稀释至1%, 取实验所需要量均匀混入实验土壤中, 用氮气吹脱石油醚。而后均匀加入5mL 营养液和接入3mL 培养好的菌液, 营养液成分见表1。按不同温度条件

14、进行实验, 一定的间隔时间取出一瓶样品, 分析土壤中石油的降解去除的含量。同时作同等条件无菌对照, 按一定时间取样测试石油的变化。第一次实验三角瓶用棉塞实验, 但时间一长则蒸发量大实验样品干燥需要不断的添加无菌蒸馏水影响实验效果。第二次实验改为具塞三角瓶, 以保证实验过程有足够的含水量, 510s , , 使实验过程中有足够的。5%, 该添加剂有两个主要作用, 一是改, 另外是为细菌作为营养素的来源, 其它实验条件同第一次实验。在一定时间取样测试石油含量的变化。表1实验用营养液成分Table 1The C omponents of the nutrient medium used in the

15、 experiment化学成分含量/(g L 21K 2HPO 43H 201. 0KH 2PO 41. 0MgSO 4. 7H 2O 0. 5N H 4NO 31. 0CaCl 20. 02FeCl 30. 013实验结果与讨论3. 1第一次土壤降解实验第一次土壤降解实验是在2007年3月30日5月14日。考虑研究区地表土壤在春、夏、秋温度一般在2030左右, 选择了不同的温度段进行实验。温度为30、25、20, 以及不同的石油含量进行实验, 并在30、25两个温度选择了平行实验。实验结果见表2。表2第一次实验石油污染土壤细菌降解石油含量随时间变化测试结果Table 2Result s of

16、 oil content s wit h time during bacterial degradation in oil contaminated soil for t he first batchmg/kg取样日期(月/日3/304/24/44/64/94/124/275/14试验天数/d035710132845302780. 01530. 01445. 0538. 0675. 0268. 0570. 0316. 0301451. 01410. 01255. 0302. 0372. 0344. 0311. 0296. 0252780. 02040. 02100. 0384. 0660. 0

17、558. 0655. 0334. 0251451. 01180. 01015. 0280. 0281. 0263. 0304. 0279. 0201451. 01370. 01490. 0525. 0638. 0503. 0585. 0292. 030对照1515. 01315. 51450. 01525. 0252790. 02840. 02710. 02780. 0注:“”表示没有测试。第6卷总第39期南水北调与水利科技2008年第6期3. 2第一次土壤修复模拟实验结果第一次土壤细菌降解石油的模拟实验显示, 微生物细菌在土壤石油污染的修复具有较好的降解作用。表2显示, 虽然模拟实验温度不同

18、, 选择的3个温度为20、25、30但实验效果基本相同。30的实验在第13d 时去除率达90%, 总的来说实验在第45d 时去除率都在80%左右, 有的达85%以上。对照样品中的石油含量变化不大, 从实验数据看基本在5%以内(30的对照第3d 数据可能有误舍去 , 说明在同等温度无菌条件下短时间内土壤中石油降解是缓慢的。研究区冬季因其气温较低一般最低温度多在-10以下, 土壤均为冻土层极大的抑制了大多数微生物的生长与活动, 限定了微生物的作用。因此研究区在冬季不适宜应用微生物方法修复大面积石油污染。3. 3第二次土壤修复模拟实验第二次土壤修复模拟实验是在2007年6月21日86日。根据第一次实

19、验结果, 高, , 30。, 5%, 该, 二是给细菌生长增加营养素。每一温度条件同时作一平行实验, 用以相互验证。实验结果见表3。表3第二次实验石油污染土壤细菌降解石油含量随时间变化测试结果Table 3Result s of oil content s wit h time during bacterial degradation in oil contaminated soil for the second batchmg/kg取样日期(月/日 6/216/297/67/107/167/308/6试验天数/d081519253037351790.0590.0207.035795.0256

20、.0795.0480.0267.0219.0186.0118.091.535对照1790.01762.030对照1790.01754.0注:“”表示没有测试。3. 4第二次土壤修复模拟实验结果第二次实验, 进一步验证微生物细菌对土壤石油污染的降解确有较好的作用。表3显示, 虽然实验选择了2个温度,35、30的实验效果基本相同,35的效果略好于30的效果。实验在第30d 时去除率都在85%左右, 大多达85%以上。35的实验30d 时都达到85%以上。从实验效果看, 第二次实验利用草坪草晾干粉碎作为添加剂, 起到了一定的作用, 使第二次实验时间虽短于第一次时间却增大了去除率, 增大5%以上。在同

21、等条件的平行实验效果也基本一致, 得到了相互验证的效果。无菌对照表明实验期内石油含量变化不大。两次实验数据均有个别反常, 分析原因:一是每个样品均为独立的实验装置, 实验过程中细菌的生长影响因素很多不可能都完全一致。如菌群在土壤中的分布是否均匀, 营养物、添加物、氧气等的加入均匀度均可影响细菌的作用。二是实验过程中石油添加的不够均匀有局部团块存在短时间内则难以降解。当然也有其它原因造成的可能。天然土壤中含有丰富的微生物, 具有潜在的降解石油污染物的能力。且可降解石油的细菌在多年连续的污油中不断驯化, 具有较强的降解石油污染物的潜力。采用投加从原来土著体系中筛选出的微生物进行生物强化, 能克服其

22、他外源菌所面临的存活力较弱、与土著微生物之间可能存在竞争关系等一系列问题, 且这种生物强化技术操作简便, 实用性强, 在生物修复方面具有较广阔的应用前景。石油是由上千种化学性质不同的物质组成的复杂混合物, 用单种微生物细菌很难将其彻底降解, , 越来越多的。如何能消除菌群, , 。本次实验通, 利用优化原位土著微生物菌群辅以物理和化学方法相结合的修复技术, 进行了实验温度、水、氧气、营养元素等的调控, 对土壤中石油的降解实验, 验证了微生物修复技术在黄土土壤石油污染降解的有效性和应用的可行性。为野外原位试验提供了经验, 奠定了基础, 积累了技术。4结论通过上述两次实验, 微生物细菌在土壤石油污

23、染的修复是有较好的降解作用。第一次实验显示, 虽然实验温度不同, 选择的3个温度的实验效果基本相同。实验在第45d 时去除率都在80%左右。有的达85%以上。第二次实验显示, 选择的2个温度, 效果也相同。实验在第30d 时去除率都在85%左右, 大多达85%以上。另外利用草坪草晾干粉碎作为添加剂, 起到了一定的作用, 使第二次实验时间虽短于第一次却增大了去除率, 增大5%以上。在同等条件的平行实验效果也基本一致, 得到了相互验证的效果。对照样品中的石油含量变化不大, 基本在5%以内, 说明在同等温度无菌条件下短时间内土壤中石油降解是缓慢的。从整个实验过程可得出土壤中石油含量在79510mg/

24、kg 、145110mg/kg 、179010mg/kg 、278010mg/kg 时, 经过3045d 微生物降解实验,土壤中石油含量降解可达77127%89106%, 为黄土土壤石油污染的修复提供了技术方法和应用的可行性。验证了本次试验调控添加的营养元素和对土壤环境的改善是比较适度的, 方法是可行的。参考文献:1Jorgensen K S , Puustinen J ,Suortti A M. Bioremediation of Pe 2troleum Hydrocarbon Contaminated Soil by Composting in Bio 2pilesJ.Environmen

25、tal Pollution ,2000,107(2 :2452254. 2Debontj A M. S olvent 2tolerant Bacteria in BiocatalysisJ.T rendsBiotechnol ,1998,16:4932499.(下转第71页张胜等石油污染黄土土壤的微生物修复实验研究主要受到三方面影响:一方面受到农产品价格的影响, 二是污灌面积逐年增大的影响, 三是蔬菜种植面积逐年增长的影响。说明近几年河北省农业用水受到明显挤占, 水资源短缺现象加重, 污灌面积增加。2004年污灌造成的直接农作物的经济损失约为2310亿元, 其中蔬菜为1918亿元, 小麦为11

26、6亿元, 玉米为116亿元, 稻谷012亿元。各年度中污灌对蔬菜的影响损失均为最大, 其次是小麦和玉米, 影响最小的是稻谷。其中蔬菜的损失占到农产品总损失86%88%, 小麦、玉米、稻谷影响程度基本相当, 原因是由于污水灌溉对蔬菜的品质和超标损失影响较大, 对大田作物稻谷、玉米、小麦影响相对较小。这充分说明, 每年污灌区产出大量的劣质农产品, 直接进入市场, 进入人们的生活, 直接关系到人们的食品安全和身体健康, 对社会的负面影响很大, 应当引起高度重视。对水污染造成的农业损失与当年的农业产业总产值进行对比, 各年度农业损失占当年农业总产值的比例2000年2004年各年度变化不大, 值的119

27、6%2107%, 4结语, 污水是灌溉水源的重要来源, 而且污灌面积逐年增大不可避免, 所以要减轻污灌对农作物的影响, 必须从加强污水的治理水平入手, 通过加强对工业废水和生活污水的处理, 使污染源能够达标排放, 农用水质能够满足农田灌溉水质标准(G B5084292 。在对水资源进行合理调配过程中, 污水灌溉尽量选取大田作物, 避免对蔬菜、水稻使用污水灌溉, 而且在污灌的过程中, 尽量采用间歇污灌和轮流污灌的方式, 充分利用自然界的自净能力, 保护农业生态环境和农产品质量不受影响, 实现农业的可持续发展, 为社会提供无污染、安全、优质的农产品。参考文献:1葛吉琦. 污染损失与环境效益分析J.

28、长江流域资源与环境,1994,3(2 :1622166.2张慧勤, 过孝民. 规划方法与模型M .北京:278.3. M .北京:中国4. 水污染造成的经济损失分析计算J.水利学报,1998,43246.5河北省统计局. 河北统计年鉴2005M .北京:中国统计出版社,2005.6河北省水利厅. 河北省水资源评价R .石家庄:河北省水利厅,2003.(上接第63页3Sanjee Mishra ,J eevan J yot. In Situ Bioremediation Potential ofan Oily Sludge 2Degrading Bacterial ConsortiumJ.Cur

29、rent Mi 2crobiology ,2001,43:3282335.4JoseL R Gallego ,Jorge Loredo ,J uan F L lamas. Bioremediationof Diesel 2Contaminated Soil :Evaluation of Potential in Situ Techniques by St udy of Bacterial Degradation J.Biodegrada 2tion ,2001,12:3252335.5WIDDL E. The Genome Sequence of an Anaerobic Aromatic 2degrading Denitrifying Bacterium Strain EbN1J.Archives of Microbiology , 2005,183:27236.6Mar n S , Khodijah Tazaiki. Bioremediation of Coastal Areas 5Years after t he Nakhodka Oil Spill in t he Sea of Japan :Isolation and Characterization of Hydrocarbon 2degrading Bacteria J .Internatio