土壤酶测定方法

1、v1.0可编辑可修改土壤磷酸酶（酸性）一一磷酸苯二钠比色法（一）试剂1. pH5醋酸盐缓冲液:A:L醋酸溶液（稀释至1000ml）B:L醋酸钠溶液A液+B液稀释至100ml若使用无水乙酸及乙酸钠配制 1升 PH为的乙酸盐缓冲液，则需要无水乙酸及乙酸钠的量计算如下:无水乙酸用量的计算：无水乙酸的浓度为，则需无水乙酸的体积为X1000/=（毫升）;乙酸钠用量的计算：查表知，无水乙酸钠的摩尔质量为82,则需无水乙酸钠的质量为X 82X 1=11 （克）。使用无水乙酸及乙酸钠配制1升 PH为的乙酸盐缓冲液的方法如下：用量筒量取毫升无水乙酸至1000毫升烧杯内，再用 台秤称取无水乙酸钠11克至该烧杯，然

2、后用量筒量取 =996毫升蒸馏水至该烧杯内，搅拌至乙酸钠溶解并 呈均匀的溶液即为1升PH为的乙酸-乙酸钠缓冲液。或者：量7ml醋酸钠液+3ml醋酸液混合即得。2. %磷酸苯二钠：pH5醋酸缓冲液3.氯代二溴对苯醌亚胺：称取 2，6-二溴苯醌氯酰亚胺，用10ml 96%乙醇（48ml乙醇+2ml水）溶解，贮存于棕色瓶中，存放在冰箱中，保存的黄色溶液未变褐色之前均可使用。4.酚标准溶液：酚原液-取1g苯酚溶于蒸馏水中，定容至1000ml水中,保存于棕色瓶中。酚工作液-取10 ml酚原液稀释至1000ml水中，每毫升含酚5.甲苯硫酸铝溶液，称取硫酸铝，定容至 100ml。（二）实验步骤1. 标线制作

3、取0, 1, 3, 5, 7, 9, 11，13ml酚工作液，置于50ml容量瓶中，加入5ml缓冲液和4滴氯代二溴对苯醌亚胺试剂，显色后稀释至刻度，30min后比色测定。以光密度值为纵坐标，浓度为横坐标绘成标准曲线。2. 样品测定称取风干土样（过20目筛，去除杂质），放置于200ml容量瓶（离心管）中, 加甲苯，轻摇15min后，加入20ml %磷酸苯二钠，仔细摇匀后放置于 37° C恒温箱中培养24h，后于培养液中加入硫酸铝溶液过滤。吸取滤液3ml于50ml比 色管中，按标准曲线方法显色，于波长 578nm处测定颜色的深度，读取吸光值。对每一土样，设置用10mL水代替磷酸苯二钠基质

4、的对照。并作空白无土对照。（三）数据计算以24小时每克土壤中释放出的酚的毫克数表示。土壤脲酶活性测定:靛酚比色法试验步骤：试剂：1）甲苯2）10%尿素：称取10g尿素，用水溶至100ml。3）柠檬酸盐缓冲液（）：184克柠檬酸和克氢氧化钾溶于蒸馏水。将两溶液合并, 用1mol/L NaOH将PH调至，用水稀释至1000毫升。4）苯酚钠溶液（L）：A:克苯酚溶于少量乙醇，加2毫升甲醇和毫升丙酮，用乙醇稀释至 100毫升,存于冰箱中;B： 27克NaOH溶于100毫升水，存于冰箱中。将AB溶液保存在冰箱中。使用前将2溶液各20毫升混合，用蒸馏水稀释至100 毫升备用。5）次氯酸钠溶液：用水稀释试剂

5、，至活性氯的浓度为 %溶液稳定。如购买的溶液是含10%舌性氯的，则计算如下：10%*原液体积（配100ml）=%（ 100ml+需加水）6）氮的标准溶液：a精确称取克硫酸铵溶于水并稀释至 1000ml，得到1ml含有氮的标准液 标准曲线绘制：吸取配置好的氮溶液10ml，加蒸馏水定容至100ml，吸取稀释的 标准液1，3，5，7, 9，11，13ml，移至50ml容量瓶，加蒸馏水至20ml，再加入4ml苯酚钠，仔细混合，加入3ml次氯酸钠，充分摇荡，放置20分钟后显色,用水稀释至刻度。1h内将着色液在紫外分光光度计上于 578nm处进行比色测定,以标准溶液浓度为横坐标，以光密度值为纵坐标绘制曲线

6、图。1）称取10g（5g）过20目筛的风干土样于100ml（50ml）三角瓶中。2）向容量瓶中加入2ml （1ml）甲苯（以能全部使土样湿润为度）并放置 15分钟。3）之后加入20ml （ 10ml） 10%尿素溶液和40ml （20ml）柠檬酸缓冲液（），并 仔细混合。4）将容量瓶放入37摄氏度恒温箱中，培养24h5）培养结束后，用热至38摄氏度水稀释至刻度,仔细摇荡，并将悬液用致密滤纸过滤于三角瓶中。与此同时，进行以水代替基质（10ml 10%尿素用10ml蒸馏水6代替），及无土对照测定。6）显色：吸取3ml滤液于50ml容量瓶中，加入20ml （10ml）蒸馏水，充分震荡，然后加入4ml

7、苯酚钠，仔细混合，再加入 3ml次氯酸钠，充分摇荡，放置 20分钟，用水稀释至刻度，溶液呈现靛酚的蓝色。7） 1h内在（靛酚的蓝色在1h内保持稳定）在分光光度计上用1cm液槽，于578nm处将显色液进行比色测定。8）无土对照：不加土样，其他操作与样品实验相同。以检验试剂纯度，整个实验设置一个对照。9）无基质对照：以等体积的水代替基质，其他操作与样品实验相同。每个土样都设此对照。结果计算：土壤脲酶活性以24小时后100g 土壤中NH3- N的毫克数表示。M=（ X样品一X无土一 X无基质）*100*10 式中：Mk土壤脲酶活性值X样品一一样品实验的光密度值在标准曲线上对应的NH3- N毫克数X无

8、土一一无土对照实验中的光密度值在标准曲线上对应的NH3- N毫克数X无基质无基质对照实验中的光密度值在标准曲线上对应的NH3- N毫克数100 样品定容的体积与测定时吸取量的比值10 酶活性单位的土重与样品土重之比值若土壤脲酶活性以24小时后100g 土壤中NHJ N的毫克数表示的话，计算如下:M=a*2a样品实验的光密度值在标准曲线上对应的NH3- N毫克数。2换算成1g 土的系数。土壤蔗糖还原酶测定方法 酶促反应试剂:1)2)磷酸缓冲液：1/15M磷酸氢二钠（-2H2O溶于1L蒸馏水）加1/15M磷酸二氢钾（KH2P0溶于1L蒸馏水中）即成。3)甲苯4）3,5-二硝基水杨酸试剂（DNS试剂

9、）：称二硝基水杨酸,溶于20ml 2mol/L NaOH和50ml水中,再加30g酒石酸钾钠，用水稀释定容至100ml（保存期不过7天）。三、操作步骤（1）标准曲线绘制：将葡萄糖现在50-58 C条件下真空干燥至恒重，然后称取 500mg溶于100ml苯甲酸溶液中（5mg还原糖/ml ）,即成标准葡萄糖标液。吸5mg/mL的标准葡糖糖溶液10m仃100ml容量瓶中，定容。从中吸取0、2、 3m1于50m1容量瓶，加DNS式剂3mL混匀，于沸水浴中准确反应5min（从试管放入重新沸腾时算起）,取出立即冷水浴中冷却至室温，定容。即为浓度为0ppm2ppm4ppm 8ppm12ppm15ppm 20

10、ppm 30ppm的标准曲线。以空白管调零在波长 508nm处比色，以0D值为纵坐标，以葡萄糖浓度为横坐标绘制标准曲线。（2） 土壤蔗糖酶测定 称取土壤，置于100mL容量瓶中，注入30ml 8%糖溶液，磷酸缓冲液和1m1甲苯。摇匀混合物后，放入恒温箱，在37C下培养24h。到时取出，迅速过滤。从中吸取 滤液2-10ml （1ml）（适量，无蔗糖对照吸取20m1）,注入50ml容量瓶中，加3m1DNS 试剂,并在沸腾的水浴锅中加热5min,随即将容量瓶移至自来水流下冷却 3min。溶液因生成3-氨基-5-硝基水杨酸而呈橙黄色,最后用蒸馏水稀释至 50m1,并在分光光度计上于508mn处进行比色

11、。（为了消除土壤中原有的蔗糖、葡萄糖而引 起的误差,每一土样需做无基质对照，整个试验需做无土壤对照：如果样品吸光值 超标曲的最大值，则应该增加分取倍数或减少培养的土样。）（3）结果计算：蔗糖酶活性以24h后1g 土壤葡萄糖的毫克数表示。葡萄糖（毫克）=a*4a代表从标准曲线查到的葡萄糖毫克数 4代表换算成1克土的系数过氧化氢酶活性测定一一容量法1.试剂配制过氧化氢溶液：将10m130%&过氧化氢用水稀释至 1L,此溶液不稳定,需临时配置。硫酸:浓硫酸溶于水,再用蒸馏水稀释至100mlKMnO4溶液:称取化学纯高锰酸钾,溶于1升蒸馏水中,贮于棕色瓶中,备用。如果知道酶活性很高的话可以适当

12、变化高锰酸钾浓度2.操作步骤 取5g（2g）过1mn风于土，置于150mL（ 100ml）三角瓶中，并注入10mL（40ml）蒸馏水和% H2O2容液。同时设置对照,即三角瓶中注入10mL蒸馏水和5mL%过氧化氢溶液,而不加土样，并作无士对照。将三角瓶放在振荡机振荡（120r/min）30min 后,加入5mL L硫酸,以稳定未分解的过氧化氢,再将瓶中是悬液用慢速型滤纸过滤，吸取 25mL滤液，用L高锰酸钾滴定至淡粉色终点。（30s不退色）3. 结果计算以单位土重消耗的L高锰酸钾毫升数（对照与试验测定的差）表示土壤过氧化氢 酶活性,其计算式为:土壤过氧化氢酶活性（ml KMn04/g干土）=（V0-V）/m式中,V0:为滴定空白（25ml过氧化氢）所消耗的高锰酸钾毫升数（m1）V:为滴定试样所消耗的高锰酸钾毫升数（ml） m为烘干土壤重量（g）或者：30min后1g 土壤过氧化氢酶活性=（V0-V）*T（ T为高锰酸钾滴定度的校