蒺藜皂苷对缺氧复氧诱导大鼠皮层神经元凋亡的影响

1、    蒺藜皂苷对缺氧复氧诱导大鼠皮层神经元凋亡的影响刘雪梅, 黄启福, 张允岭【摘要】  目的：观察蒺藜皂苷（Tribulus terrestris L. saponion, TTLS）对大鼠皮层神经元经缺氧复氧后细胞凋亡的影响，并探讨其可能的作用机制。方法：离体培养大鼠皮层神经元，先用95% N2与5% CO2混合气体造成细胞缺氧3 h，再给予95% O2与5% CO2混和气复氧12 h，建立缺氧复氧损伤的皮层神经元凋亡模型。中药组于缺氧复氧时均加入TTLS进行干预。Annexin VFITC/碘化丙啶（propidium iodide,

2、PI）双染，流式细胞仪定量分析细胞凋亡百分率；JC1荧光染色，激光扫描共聚焦显微镜观察细胞线粒体膜电位的变化，荧光酶标仪测定神经元胞浆内caspase3/7的活性，并采用免疫细胞化学法观察细胞Bax蛋白表达情况。结果：细胞缺氧3 h复氧12 h后，凋亡率明显增加，线粒体膜电位显著降低，胞浆内caspase3/7活性增多，Bax蛋白大量表达（P<0.01）。TTLS能抑制缺氧复氧损伤的皮层神经元线粒体膜电位的降低，减少caspase3/7活性，并可降低Bax蛋白的表达，从而抑制细胞凋亡的发生。结论：缺氧复氧可以诱导皮层神经元的凋亡。TTLS可降低缺氧复氧诱导细胞凋亡的发生，其机制与维持线粒

3、体膜电位的稳定，抑制caspase酶活性，降低Bax蛋白表达有关。【关键词】  蒺藜 神经元 细胞凋亡 线粒体 缺氧Effects of Tribulus terrestris L. saponion on apoptosis of cortical neurons induced by hypoxiareoxygenation in ratsXuemei LIU, Qifu HUANG, Yunling ZHANG, Jinli LOU, Hongsheng LIU, Hong ZHENGCenter of Science Experiment, Dongfang Hospital

4、, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100078, ChinaDepartment of Pathology, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, ChinaObjective: To observe the effects of Tribulus terrestris L. saponion (TTLS) on apoptosis in cortical neurons induced by hypoxiareoxygenation in rats.Me

5、thods: Primary culture of rat cortical neurons was performed in vitro. A model of apoptosis of cortical neurons was established by hypoxia and reoxygenation. Hypoxia for 3 h in neural cells was induced with mixture of 95% N2 and 5% CO2, and then reoxygenation in neural cells was induced with mixture

6、 of 95% O2 and 5% CO2 for 12 h. Different concentrations of TTLS were administered to traditional Chinese herbal medicinetreated group separately during hypoxia and reoxygenation. The apoptosis rate was analyzed quantitatively by flow cytometry with Annexin VFITC and propidium iodide staining. Mitoc

7、hondria membrane potential was observed by a confocal laserscanning microscope with JC1 fluorescence. Caspase3/7 activity in cytoplasm was measured by fluorescent plate reader. Bax protein expression was observed by immunohistochemical technique.Results: The percentage of apoptosis was significantly

8、 increased, mitochondria membrane potential was obviously decreased, fluorescence of caspase3/7 activity was increased, and Bax protein was abundantly expressed followed by 3 h of hypoxia and 12 h of reoxygenation (P<0.01). TTLS could inhibit the depression of membrane potential induced by hypoxi

9、a and reoxygenation, decrease the activity of caspase3/7, reduce the expression of Bax protein, and inhibit the apoptosis of the cortical neurons.Conclusion: Hypoxia and reoxygenation can induce apoptosis of rat cortical neurons. TTLS can decrease the apoptosis induced by hypoxia and reoxygenation.

10、The mechanism might be related to stabilization of mitochondria membrane potential, inhibition of caspase activity and reduction of Bax protein expression.Keywords: Tribulus terrestris; neurons; apoptosis; mitochondria; anoxia蒺藜皂苷(Tribulus terrestris L. saponion, TTLS)是从吉林产蒺藜地上全草中提制,主要包括呋甾醇和螺甾醇两类皂苷。

11、大量研究证实TTLS具有增加脑血流量，减轻脑含水量，减少脑梗死面积等作用13。前期研究证实心脑舒通胶囊(主要成份为TTLS)对大鼠急性多发性脑梗死脑缺血病变有明显的改善作用4，并且TTLS可抑制皮层神经元凋亡的发生。本实验在对原代培养的大鼠大脑皮层神经元缺氧缺糖后，进行给氧给糖处理,观察TTLS对皮层神经元凋亡以及线粒体膜电位变化的影响,从凋亡机制上进一步探讨TTLS对缺氧复氧后大鼠皮层神经元凋亡的影响。1  材料和方法1.1  主要药品与试剂  TTLS冻干粉由吉林省敖东洮南药业股份有限公司提供；高糖达尔伯克改良伊格尔（Dulbecco's modifi

12、ed Eagle's medium, DMEM）培养基、Neurobasal Medium、B27 supplement购自Gibco公司；胎牛血清、马血清购自Hyclone公司；胰蛋白酶、多聚赖氨酸（MW 1.5×1053.0×105）、JC1购自Sigma公司；AnnexinFITC/碘化丙啶（propidium iodide, PI）凋亡检测试剂盒购自北京宝赛生物技术有限公司； ApoONE Homogeneous Caspase3/7 Assay购自Promega；Bax鼠单克隆抗体、即用型快速免疫组化MaxVisionTM试剂盒、浓缩型二氨基联苯胺（dia

13、minobenzidine, DAB）试剂盒购自福州迈新生物技术开发有限公司。1.2  主要仪器  CO2培养箱（SHELLAB 2323）；低温高速多功能离心机（Eppendorf 5415D）；荧光酶标仪（BIOTEK FLx800）；激光扫描共聚焦显微镜（Olympus FV500IX81）；流式细胞仪（Beckman Coulter Epics Altra）。1.3  皮层神经元的原代培养  参考文献5，6对皮层神经元进行原代培养。取出生12 h以内Wistar大鼠（雌雄兼用，由中国医学科学院实验动物中心提供）。无菌条件下取出全脑，在解剖显微镜下

14、剥离脑膜，分离出大脑皮层，将其剪成约1 mm3大小组织块，用终浓度为0.125胰蛋白酶溶液37 消化30 min。含10胎牛血清和10马血清的高糖DMEM中止消化2次，细口径吸管反复轻轻吹打成均匀的细胞悬液。200目筛网过滤，收集过滤后的单细胞悬液，接种于预先经0.01%多聚赖氨酸浸泡的无菌塑料培养板中。细胞于37 、5% CO2培孵箱中培养。24 h待细胞贴壁后，换无血清培养液（98 Neurobasal medium2 B27），以后每3 d换无血清培养液1次（换半液）。培养78 d的神经细胞用于实验。1.4  模型制备和实验分组  取培养78 d的神经细胞，吸除原培养

15、液，加入无糖Earle's液，置于缺氧盒中，通入95% N2和5% CO2的混合气体30 min（流量1.5 L/min），随后密闭缺氧盒，置37 、5% CO2的培养箱中孵育3 h，在此基础上，再换成正常培养液（作为复氧液）继续放入37 、5% CO2的培养箱中孵育12 h，制备为缺氧复氧模型。    实验分为正常对照组，用正常培养液孵育，不缺氧；模型组；TTLS组，缺氧液和复氧液中均加入TTLS，余同模型组。1.5  检测指标1.6  统计学方法  实验数据以x±s来表示。应用SPSS软件作统计分析，组间均数比较

16、采用单因素方差分析，并作独立样本的t检验。2  结果2.1  TTLS对缺氧复氧损伤后皮层神经元活力的影响  预实验中观察到缺氧3 h复氧不同时间对皮层神经元有损伤，在缺氧3 h复氧12 h时损伤明显，因此，本实验选用缺氧3 h复氧12 h作为诱导皮层神经元凋亡的时间。    MTT结果显示，模型组细胞活性明显低于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）；与模型组比较，0.003 g/L的TTLS对神经细胞活力无改善作用，随着TTLS浓度增大，神经细胞的活力也逐渐升高，差异有统计学意义。其中0.025 g/L与0.05 g/L的

17、TTLS对细胞活力改善尤为明显（P<0.01），二者之间比较，差异无统计学意义。由于药物浓度过大对细胞也有一定的损伤作用，因此本实验选用TTLS浓度为0.025 g/L作为药物干预的浓度。见表1。表1  TTLS对缺氧复氧损伤后皮层神经元活力的影响（略）Table 1  Effects of different doses of TTLS on viability of rat cortical neurons injured by hypoxiareoxygenation*P<0.05 vs normal control group; P<0.05, P

18、<0.01 vs untreated group.2.2  流式细胞仪检测神经元凋亡率的变化  流式细胞仪收集细胞得到的散点图中，Annexin VFITC和PI双标记的区域，即第4象限，代表早期凋亡细胞。结果显示，当缺氧3 h复氧12 h后，凋亡细胞比例明显多于正常组（P<0.01）；0.025 g/L TTLS治疗后，细胞凋亡率明显降低于模型组，差异有统计学意义（P<0.01）。提示缺氧3 h复氧12 h会导致皮层神经元损伤，损伤以早期凋亡为主，TTLS可以通过抑制细胞凋亡发挥作用。见表2和图1。表2  TTLS对缺氧复氧损伤后皮层神经元凋亡

19、率的影响（略）Table 2  Effects of TTLS on apoptosis rate of rat cortical neurons injured by hypoxiareoxygenation*P<0.01 vs normal control group; P<0.01 vs untreated group.2.3  激光扫描共聚焦显微镜观察线粒体膜电位的改变  采用JC1荧光标记检测神经细胞内线粒体膜电位，其在低膜电位下发绿色荧光（发射峰527 nm），在较高电位时形成J聚集体，发红色荧光（发射峰590 nm），分别测定每个细胞在第

20、1通道（绿色）和第2通道（红色）的荧光强度，用红/绿荧光强度的比值反映细胞膜电位变化趋势。采用Fluoview Version 4.3软件采集分析图像。每组随机取10个细胞，以每个细胞得到的15个荧光强度值的均值为此细胞的膜电位的平均荧光强度值。正常神经细胞红、绿色荧光均明显，线粒体膜电位较高，缺氧3 h复氧12 h后，绿色荧光明显，红色荧光非常低弱，线粒体膜电位下降明显，与正常组比较差异有统计学意义（P<0.01）；0.025 g/L TTLS治疗组神经细胞的红色荧光明显增强，线粒体膜电位明显升高（P<0.01）。见图2和图3。图1  流式细胞仪检测皮层神经元凋亡率（略

21、）Figure 1  Apoptosis rate of cortical neurons in rat tested by flow cytometry with Annexin VFITC/PI stainingA: normal control group; B: untreated group; C: 0.025 g/L TTLStreated group.图2  激光扫描共聚焦显微镜观察皮层神经元线粒体膜电位变化（略）Figure 2  Changes of mitochondrial membrane potential in cortical neu

22、rons tested by laser scanning confocal microscopy with JC1 stainingA: normal control group; B: untreated group; C: 0.025 g/L TTLStreated group.图3  TTLS对缺氧复氧损伤后皮层神经元线粒体膜电位的影响（略）Figure 3  Effects of TTLS on membrane potential of rat cortical neurons injured by hypoxiareoxygenation.*P<0.01

23、 vs normal control group; P<0.01 vs untreated group; n=10.2.4  荧光酶标仪检测caspase3/7酶活性  当皮层神经元遭受缺氧3 h复氧12 h后，caspase3/7酶的活性大量表达，明显高于对照组（P<0.01）。给予0.025 g/L TTLS治疗后，caspase3/7酶的活性低于模型组，差异有统计学意义（P<0.01）。见表3。2.5  免疫细胞化学法观察Bax蛋白表达  免疫细胞实验表明,缺氧前神经元有少量Bax表达, Bax蛋白主要分布于神经元胞浆、突起及核膜

24、上,呈棕黄色细小颗粒状,细胞核不着色。缺氧3 h复氧12 h后，神经元Bax表达增强，着色深。0.025 g/L TTLS治疗组Bax表达降低，着色变浅。见表4和图4。表3  TTLS对缺氧复氧损伤后皮层神经元caspase3/7活性的影响（略）Table 3  Effects of TTLS on caspase3/7 activity in rat cortical neurons injured by hypoxiareoxygenation*P<0.01 vs normal control group; P<0.01 vs untreated group

25、.表4  TTLS对缺氧复氧损伤后皮层神经元Bax蛋白表达的影响（略）Table 4  Effects of TTLS on Bax protein expression of rat cortical neurons injured by hypoxiareoxygenation*P<0.01 vs normal control group; P<0.01 vs untreated group.图4  TTLS对缺氧复氧损伤后皮层神经元Bax蛋白表达的影响（略）Figure 4  Effects of TTLS on Bax protein

26、 expression of rat cortical neurons injured by hypoxiareoxygenationA: normal control group; B: untreated group; C: TTLStreated group.3  讨论    缺血性脑卒中是临床上最常见的脑血管疾病之一，临床上给予再灌注治疗后非但没有减轻病情，反而加重脑损伤。脑缺血再灌注诱发的脑损伤主要是由于缺氧、兴奋性氨基酸、钙离子超载等各种因素引起的脑神经细胞发生凋亡或坏死7，其中凋亡是一个早期发生、动态持续、可逆转的异常过程，给予药物干预可能

27、会逆转这一损伤过程。因此，我们采用体外培养皮层神经元，给予缺氧复氧诱导神经细胞凋亡，应用Annexin VFITC和PI双染法标记早期凋亡细胞，流式细胞仪检测早期细胞凋亡率，结果证实，缺氧3 h复氧12 h能明显诱导皮层神经元的大量凋亡，TTLS（0.025 g/L）可以减少神经元凋亡的发生。Susin等8认为线粒体是细胞早期凋亡的关键因素之一，在经典的凋亡信号出现之前，线粒体膜完整性已经开始改变，线粒体内、外膜的变化导致线粒体膜电位的崩解和各种凋亡诱导因子（如细胞色素C）的释放。因此，可以说线粒体膜电位的降低是凋亡级联反应中最先发生的重要标志之一9，它的降低标志着线粒体膜结构出现不可逆的改变

28、，内膜通透性增高，进而外膜肿胀、破裂，最终导致线粒体内细胞色素C释放，是激活caspase酶的启动者和执行者，可诱导caspase介导的蛋白质变性、DNA降解，染色质凝聚，细胞凋亡。其中caspase3是caspase级联反应下游最关键的凋亡蛋白酶，在各种因素启动的凋亡程序中起着最后的枢纽作用10，11。Bax是Bcl2家族中最主要的促凋亡蛋白，在凋亡信号刺激下由细胞胞浆转运到线粒体膜上，引起线粒体膜通透性转变孔开放，促使线粒体释放细胞色素C，激活caspase酶，最终导致细胞凋亡12。因此我们通过检测线粒体膜电位、caspase3活性和Bax蛋白表达，试图解释TTLS对缺氧复氧诱导的皮层神经

29、元凋亡的保护作用。    蒺藜属蒺藜科植物（Tribulus terrestris L.），具有平肝解郁、活血祛风、明目、止痒之功效13。TTLS是从蒺藜地上全草中提取，为蒺藜草的主要有效成分，主要包括呋甾醇和螺甾醇两类皂苷，是以甾体皂苷为主的十多种皂苷的混合物。研究发现TTLS对脑动脉硬化症和脑血栓形成后遗症有较好的疗效，能增加脑缺血部位的血供，减轻脑含水量，减少脑梗死面积，改善脑循环，保护缺血脑组织2，3，14。以TTLS为主要成分制成的心脑舒通胶囊和心脑舒通片早已在临床上广泛使用，在心、脑血管疾病方面有着良好的疗效。本实验采用荧光探针JC1的荧光强度来反映线

30、粒体膜电位的高低，以caspase3的活性以及Bax蛋白的表达来了解细胞凋亡时的功能变化。结果发现缺氧3 h复氧12 h可明显诱发细胞线粒体膜电位下降，caspase3/7酶的活性显著增加，Bax蛋白有大量表达，而TTLS预处理可增加缺氧复氧神经细胞线粒体膜电位而抑制caspase3/7酶的活性，并降低Bax蛋白的表达，从而有效地发挥其抗凋亡作用。由此，我们得出缺氧复氧诱导皮层神经元的凋亡，TTLS能减少缺氧复氧后细胞凋亡的发生，其机制与维持线粒体膜电位的稳定，抑制caspase3酶激活，降低Bax蛋白表达有关。【参考文献】  1 Chu SD, Qu WJ, Li M, et al