藤茶提取物及其主要成分二氢杨梅素对大豆油和熟牛肉的抗氧化性

1、 藤茶提取物及其主要成分二氢杨梅素对大豆油和熟牛肉的抗氧化性【摘要】分析和比较藤茶的提取物和它的主要成分二氢杨梅素在两个系统中即大豆油和熟牛肉中的氧化活性。大豆油样品的氧化性测定通过使用过氧化值,茴香胺值,顶部空间挥发物和顶部空间的氧含量。使用TBARS(硫代巴比土酸活性物质)测试去测量煮熟的牛肉的氧化性。DHM比BHA能更有效地预防大豆油氧化。EXT在大豆油中的作用并不像BHA或DHM一样有效。在熟的牛肉,这三种抗氧化剂与控制的相比能显著降低氧化程度,但是这三者之间的作用没有区别。EXT和DHM做为天然食品抗氧化剂的机理需要研究具体问题具体分析。1.【前言】 脂质氧化是限制许多食品保质期的最

2、重要因素之一。合成的抗氧化剂，如叔丁基羟基茴香醚（BHA）、二丁基羟基甲苯（BHT），叔丁基氢醌（TBHQ）、没食子酸丙酯（PG），通常添加到食品中去抑制食品的氧化。在最近的几十年中，合成抗氧化剂的安全性问题已经导致了消费者对天然的替代品的兴趣。因此，研究人员正在不断寻找新的天然抗氧化剂。 藤茶（族：葡萄科；属：蛇葡萄属）是一种野生植物，生长在中国的华南山区。它干燥过的叶和茎，称为藤茶或茅岩莓，已被作为一种保健茶和草药来消费了数百年。已经有人研究了这种植物的营养概况（陈等人，2007，杨，和熊，2001），毒性（中，周，和陈，2003，2001），和生物活性成分（高等人，2009，田，张，杨，

3、杨，和2002）。二氢杨梅素（DHM），是二氢黄酮醇，也被称为蛇葡萄素，被发现为藤茶中最丰富的生物活性成分（高等人，2009；田等人，2002）。 高等人（2009）测量藤茶提取物和DHM的清除DPPH自由基活性，并报道了DHM的清除DPPH自由基活性比TBHQ高得多。在过去的十年中，自由基清除试验，如自由基DPPH，已被用于抗氧化活性的筛选和预测，但这些测定的意义受到质疑（弗兰克尔和迈耶，2000）。为了验证在实际应用中的抗氧化剂的有效性，在脂质底物或食物模型中的的检测是非常必要的。 王和同事测试了藤茶提取物在猪油中的抗氧化活性（王、田，熊，和张，2004）。猪油样品处理在200 ppm的粗

4、提物比起200 ppm的TBHQ有明显更低的过氧化值和控制存储。然而，过氧化值只是一个衡量的主要氧化产物得方法。总体氧化水平和抗氧化效果应该基于初级和次级氧化产物的评价（德克尔，华纳，理查兹，夏海迪，2005）。一些抗氧化剂，如维生素E，能通过提供氢增加过氧化物的形成（初级氧化产物）而降低挥发性二次氧化产物的生成。其他化合物，如过渡金属，可以减少过氧化值，同时增加二次氧化产物。在这项工作中，无论是初级还是次级氧化产物进行测定都用于评估抗氧化剂的有效性。 在我们的研究中，豆油和牛肉作为测试和比较藤茶提取物（EXT）,DHM和BHA的抗氧化活性的底物。由于它们的的广泛使用并且易氧化，豆油已用作底物

5、来测试处理对氧化的影响和抗氧化剂的功效。过氧化值、顶空挥发物、茴香胺值，以及不同的抗氧化治疗的豆油样品顶空氧含量被用作去估算抗氧化剂的有效性。煮熟的牛肉被用作一个更复杂的矩阵来测试这些抗氧化剂。TBARS试验测定牛肉样品氧化性由于其具有良好的相关感官特性。（费尔南德兹，佩雷斯，阿尔瓦雷斯，&洛佩兹费尔南德兹，1995）。2.【原料和研究方法】2.1藤茶提取物(EXT)的制备从中国张家界三个茶叶店购买相同的藤茶（干叶藤茶茎）。取用10克的茶叶，加入200毫升74%（体积/体积）乙醇水溶液后，在设置为65摄氏度的精密科学360个轨道振动筛（芝加哥，）中提取藤茶提取物。提取液通过孔径为125 大小的

6、过滤袋。使用温度设置为60度的旋转蒸发仪R-3000（弗拉维尔，瑞士）蒸发提取液中的乙醇。残渣冻结并在50C的冷冻干燥机中冷冻干燥3天。冻干提取物（EXT）在分析天平称重并存储在20的情况下以便之后的使用。相同的步骤是重复使用去制备三个单独的提取物。2.2用高效液相色谱分析冻干提取物中DHM含量使用安捷伦1260 无限系列高效液相色谱（里士满，VA）和安捷伦 120 ec-c18柱（5cm x 0.46厘米，2.7微米的颗粒大小）来分析冻干提取物中DHM的含量。流动相A为0.1%（体积/体积）的乙酸水溶液，流动相B为0.1%（体积/体积）在乙腈中的乙酸溶液。流动相由90%的A和10%的B组成，

7、柱子流速为0.5毫升/分钟。该柱在室温下操作。DHM的标准曲线在0、0.25、0.50、0.75、和1mg/ml中的甲醇溶液中绘制。样品在1毫克/毫升甲醇中制备提取。标准/样品注入量为5微升。记录在290nm紫外吸收率和在190nm至400nm的紫外吸收光谱。2.3总酚含量（TPC）采用在1990年斯潘诺斯和科尔斯塔实验报道过的福林酚法测定总酚。在使用之前，分别配制0，0.1，0.2，0.3，0.4，和0.5mg/ml的没食子酸，0.5mg/ml提取物溶液，0.5mg/mlDHM溶液。每100微升的样品和标准品在10ml的试管中用900微升的蒸馏水稀释，然后将它们分别在旋涡混合器与2.5ml0

8、.2N的福林桥高特试剂、2毫升饱和碳酸钠混合。2小时后，使用紫外岛津UV-2550紫外可见分光光度计（哥伦比亚，MD）读出每个反应混合物在765 nm处的吸光度。2.4DPPH自由基清除能力用紫外可见分光光度计测量不同浓度的EXT，DHM，和BHA的DPPH自由基的清除活性。在使用前，立即制备抗氧化的标准（0，10，20，40，60，80，100微米）和在50%（v/v）乙醇水溶液制备六个不同浓度（2，4，6，8，10，12 ppm）的Ext，DHM，和BHA。每2.5 mL的标准品和样品加入2.5ml的DPPH溶液（0.2mMDPPH的乙醇溶液）。在室温下，经过30分钟的反应后，读取在515

9、nm处的每个反应混合物的吸光度。用公式：Abscontrol（AbssampleAbsblank）/Abscontrol*100%计算DPPH自由基清除能力并绘制的样品浓度获得IC50值（浓度产生了50%的抑制作用）。2.5在豆油中的抗氧化活性2.5.1油样品的制备所有的天然黄油纯植物油（大豆油）是从当地的杂货店购买。豆油样品用不同的抗氧化处理（控制，200 ppm的BHA，200 ppm的EXT，200 ppm的DHM，和200 ppm的DHM + 200 ppm的BHA）制备。每个处理，用五十四个在10ml玻璃离心瓶中5ml的油样，和三个在顶空瓶中5ml油样品制备。所有这些样品被随机分布在

10、一个温度设定在60摄氏度（用温度计验证温度）的精密重力对流培养箱（芝加哥，IL）。在0，3，6，9，12，和15天时，从每个玻璃离心瓶的处理样中随机挑选九个样品，去一式三份地测定它们的过氧化值、顶空挥发性和茴香胺值。并在同一天测定油样品在顶空瓶的顶空氧含量（0，3，6，9，12，15天）。2.5.2过氧化值使用AOCS（美国油脂化学家协会）的官方方法CD 8-53（美国油脂化学家协会，1998）测定用不同抗氧化物质处理过的油样品的过氧化值。简而言之，将4g油，30ml乙酸氯仿溶液（3:2，体积/体积），和0.5ml饱和碘化钾溶液混合在一个125ml的玻璃塞的锥形瓶。在正常的旋转大约一分钟后，烧

11、瓶加大摇摆从有机层中分离出碘。反应混合物中加入1ml淀粉指示剂。然后将混合物用0.1硫代硫酸钠滴定至蓝灰色的颜色消失。对滴定剂体积的记录精确到0.01毫升。2.5.3。茴香胺值通过AOCS机构方法CD 18-90（美国油脂化学家协会，1998）测定在不同处理后的油样的茴香胺值。用分析天平称量约2ml的油样品加入一个50毫升塑料离心管中并与23ml异辛烷混合。用分光光度计测量该溶液在350nm处的吸光度，使用异辛烷作为空白对照。然后，将此溶液5ml与1ml茴香胺试剂（2.5 g / L冰乙酸作为溶剂）混合。10分钟后，测定在350 nm各反应混合物的吸光度，以5ml异辛烷和1ml对茴香胺的混合物

12、为空白。利用公式计算了茴香胺值：AnV = 25（1.2As-Ab）/ m，As是指反应混合物的吸光度，Ab是石油样品溶液的吸光度，m是油量。2.5.4顶空挥发性化合物的用固相微萃取-气相色谱质谱（SPMEGCMS）分析顶空挥发物。该系统包括一个拥有HP-5MS柱（30m X 0.25mm.i.d X 0.25um膜厚度）的休利特帕卡德5890A气相色谱（安捷伦科技，里士满，VA），休利特帕卡德5972质谱仪（安捷伦科技，里士满，VA），和有固相二乙烯基苯/碳分子筛 /聚二甲基硅氧烷纤维（贝尔丰特，PA）的CTC分析自动进样器（跳跃技术，卡尔伯罗，数控）。将约每4g油样品从原来的储存瓶转移到1

13、0 mL顶空瓶并用聚四氟乙烯内衬硅胶瓶盖密封。纤维在40顶空孵育30分钟去吸收挥发物，然后在气相色谱的入口被解吸12分钟。设定进气温度为250，检测器温度为220，烘箱温度保持1分钟的45，再以10/min加热，使温度从45上升到210，然后保持在2105分钟。每个样品的总运行时间为22.5分钟。氦气作为载体的使用，气体流速为1ml/min（约25cm/s的线性流速）。该质谱仪操作在从40 m / z到550 m / z ASTM d2887校准溶液（Supelco，PA）的扫描模式中进行分析，得到系统的保留指数，并用来验证通过质谱鉴定的化合物。2.5.5顶空氧含量顶空氧含量用光氧分析仪400

14、0b（oxysence，Inc.，达拉斯，德克萨斯州）测量。为了准备这个分析的样品，两个样品的准备，将一个荧光氧传感器先用一个半透明硅胶粘住顶空瓶的内部表面。当胶已经凝固后，将5ml油样品分别放入玻璃瓶和用一个瓶盖是聚四氟乙烯衬里的压接帽完全密的玻璃瓶。分在第0，3，6，9，12，和15天的时候，从60保温箱中拿出去测量氧含量。在冷却至室温后，每个玻璃瓶放置在有荧光氧传感器的光圈阅读栏的前端，以每5s一次的速度共测量5次其荧光性。数据通过系统自动记录到Excel 工作表中。测量进行在一个黑暗的房间以实现最好的信噪比。 2.6TBARS试验生牛肉是由弗吉尼亚理工大学肉实验室捐赠（布莱克斯堡，弗吉

15、尼亚州）。四个牛肉处理样品（控制：200 ppm的BHA，200 ppm的DHM，和200ppm的EXT）制备如下：BHA，DHM，或EXT（44mg）i8 9 溶解在20ml的20%（V/V）的乙醇水溶液，再加入200 g生牛肉，获得含200 ppm的抗氧化剂（对照组中还含有乙醇）的牛肉样品。把样品均匀地分配到三个50ml离心管（45g每管），在300 x g离心。将这些生牛肉样品放入在95摄氏度的水浴中煮，直到内部温度达到160华氏度（71摄氏度），然后冷却至室温。所煮的样品水分被排干，放置在托盘中，用聚氯乙烯薄膜覆盖，并存储在4摄氏度。在第1天，7天和14天时，每份样品各测三次TBARS

16、值。TBARS试验的方法由斯帕尼尔和泰勒（1991）发明，并由凯夫和王（2006）改进。将约5g牛肉样品用65ml蒸馏水，0.1ml10%十二烷基硫酸钠（SDS），和10ml溶液III（0.05 g没食子酸丙酯、0.10 g乙二胺四乙酸和500ml蒸馏水制成的）均质化，直到有没有明显的固块。用二十毫米的蒸馏水冲洗均质头，并结合匀浆。为了减少氧化过程地发生，所有的烧杯放在一个装满冰的盒子里。TMP配制成浓度为0、2.5、5、7.5和10.0um的标准溶液。每个样品匀浆液（1ml），每个标准溶液（1ml）与4ml溶液I（0.375% TBA、0.506% SDS，9.370%乙酸，pH值为3.4；

17、4毫升）混合。混合液在95 摄氏度水浴中搅拌60分钟，冷却到室温，每个反应混合物与5ml溶液II（15:1的正丁醇和吡啶V / V）混合。将反应混合物搅拌10s和3500 rpm（1000 x g）离心25分钟。在532nm处都吃顶部层的吸光度。2.7统计分析所有测试结果的统计分析用SAS（版本9.1.3，2003，SAS，卡里，NC）采用单因素方差分析与一般线性模型。如果模型有显著性（P0.05），抗氧化剂的主要作用采用图基多重测试（P0.05）被分开。在同一个实验装置的顶空氧含量进行测定，随着时间的推移，重复测量分析氧含量的数据。3【结果】3.1藤茶和EXT的DHM含量和总酚含量（TPC）

18、在提取、冻干后，10g干藤茶产生了3.49g提取物（黄色粉末）。高效液相色谱分析结果表明，干提取物含有约64.7%（w/w）的DHM。假设DHM完全是从茶叶中提取的，这种藤茶含有以干重为基础约22.6%（w/w）的DHM。在福林酚法中，1g的DHM反应为783mg的没食子酸标准。因此，DHM的TPC值被记录为783mg没食子酸当量（GAE）每克，或783毫克GAE /克。同样，提取物的TPC值为649mgGAE /克。3.2DPPH自由基清除能力BHA,DHM和EXT的DPPH自由基的清除活性BHA，DHM如图1所示。EXT有比起同浓度的BHA和DHM（P0.05）的活性明显更低。超过3 pp

19、m水平的DHM比BHA（P0.05）更高的活性。BHA，DHM和EXT的IC50，分别是2.8 ppm，2.8 ppm和3.9 ppm。 3.3在豆油中的抗氧化活性3.3.1过氧化值所有的油样品的过氧化值显著增加超过15天（图2a）。6天之后，用DHM，EXT，和BHADHM处理过的有样品比对照的BHA处理油（P0.05）有比较低的过氧化值。用BHA处理的豆油在最初12天内有更低的过氧化值。然而，在第15天，其过氧化值超过了控制。五种方法的效果差异（P0.05）。用DHM处理的大豆的过氧化值最低。3.3.2茴香胺值茴香胺值（AnV）实验在油中测量不挥发性的二次氧化产物（图2b）。在6天的氧化作

20、用后，用DHM，EXT，和BHADHM处理的油样比控制和BHA处理油（P0.05）有明显更低的AnV。3.3.3顶空挥发物每个豆油样品的总挥发物（峰面积）如图2c所示。经过15天的氧化后，提取的样品比对照组有明显更高的总挥发物（P0.05）。所有其他的样品有较低的总挥发物比对照组（0.05）。1-戊烯-3-醇、2-己烯醛、烯、1-辛烯-3-醇经常被报道在大豆氧化产物中（斯奈德，弗兰克和塞尔克，1985；斯奈德，弗兰克尔，塞尔克，和瓦尔纳，1988）。每个样品中的这些化合物的峰面积如图3所示。DHM和BHADHM都非常有效的抑制这四种挥发物形成。BHA和EXT比DHM和BHADHM的效果要低得多

21、。3.3.4顶空氧含量在控制和用BHA处理的大豆油的顶空氧含量显著下降（图2d）。在6天后，用DHM，EXT，和BHADHM处理的油样比控制和BHA处理的油样（P0.05）在顶空具有更高的氧含量。含有DHM的油具有最高的顶空氧水平。3.4在熟牛肉中的抗氧化活性用BHA，DHM和EXT处理的牛肉样品比对照组有更低的TBARS值（P0.05）（图4）。在第1天，第7天，BHA比DHM和EXT显示出更高的抗氧化活性。在第14天，DHM和EXT和BHA的影响无明显差异。4【讨论】二氢杨梅素由于其丰富，来源广泛长，安全消费历史，高的清除自由基的活性，是一种用于食品的很有前途的天然抗氧化剂，并对大豆油，熟

22、牛肉有高的抗氧化性。在这项研究中，从藤茶（干藤茶）中提取二氢杨梅素，因为这种茶很容易得到。以干重计算，每十克的藤茶约产生2.26g二氢杨梅素。田等（2002）估算了植物藤茶不同部位的DHM的含量。以干重计，叶子含有27.35%3.61% 的DHM，而叶和茎的混合物含有23.40%1.62%的DHM。我们试验中所用的藤茶样品中所含的叶和茎。二氢杨梅素也存在于其他植物，如枳椇（奥沙瓦，和基姆，2005）和粤蛇葡萄（陈、王、蔡，和陈，1997）。由于酚类抗氧化剂主要是通过他们的清除自由基的活动来作用的，本研究的一个初始步骤就是通过测定DPPH自由基清除能力来估计二氢杨梅素的抗氧化能力。二氢杨梅素比B

23、HA有更高的抗氧化能力。高等人（2009）发现DHM比起TBHQ也有显着较高的DPPH自由基清除能力。然而，DPPH是一种稳定的合成氮基，即与在脂质过氧化反应中的过氧自由基不相似。许多抗氧化剂，与过氧自由基快速反应但可能与DPPH（普耐尔，吴，和斯查其，2005）慢慢反应。豆油和煮熟的牛肉被选择作为模型系统，以进一步探讨二氢杨梅素的抗氧化活性。二氢杨梅素对大豆油氧化优于BHA，由四个试验确定（PV，AnV，顶空挥发物和顶空氧）。二氢杨梅素（200 ppm）和BHA（200 ppm）。之间不存在协同效应。在煮熟的牛肉中，二氢杨梅素的效果与BHA类似。 藤茶（干藤茶）提取物也具有较高的总酚含量和高的自由基清除能力。根据TBARS实验，它对熟牛肉有抗氧化效应，但在抑制二次氧化作用中无效果。取干藤茶10g，平均得到3.49g的总提取物（淡黄色粉末）。高效液相色谱分析表明，该提取物中含有64.7%